ABCG1 i HDL chronią przed dysfunkcją śródbłonka u myszy karmionych dietą bogatą w cholesterol ad 5

Zbadaliśmy wpływ supresji ABCG1, ABCA1 i SR-BI przez transfekcję siRNA na cholesterol z udziałem HDL i masowy wypływ 7-KC. Western blot wykazał skuteczną supresję ABCG1 i SR-BI; jednak ABCA1 nie był łatwo wykrywany w komórkach traktowanych agonistą X, nieotrębnionych z receptorem X (Figura 6B, wkładka). Tłumienie ABCG1 znacząco zmniejszyło zarówno wypływ masy cholesterolu, jak i 7-KC (Figura 6B). Ani zahamowanie ABCA1, ani SR-BI nie wpłynęło na cholesterol ani na masowy wypływ 7-KC (Figura 6B). Dane te wskazują, że szlak wypływu sterolu, w którym pośredniczy ABCG1, jest dominujący w HAEC. Figura 6 Wpływ ABCG1 i HDL na wypływ steroli w HAEC. (A) HAEC obciążano cholesterolem lub mieszaniną 7-KC (każde 5 ug / ml) przez 24 godziny. HAEC przemyto PBS i inkubowano z różnymi akceptorami przez 16 godzin. (B) HAEC transfekowano za pomocą wymieszanego, siRNA ABCG1, ABCA1 lub SR-BI. Dwadzieścia cztery godziny po transfekcji HAEC inkubowano z cholesterolem (5 .g / ml) lub 7-KC (5 .g / ml) przez 24 godziny. HAEC następnie przemyto PBS i inkubowano z HDL2 (50 .g / ml lub bez) przez 16 godzin. Wyniki są reprezentowane jako średnie. SEM 3 indywidualnych eksperymentów. Inset: Western blot dla ABCG1 i SR-BI. Wpływ ABCG1 i HDL na poziomy dimerów eNOS. Zbadaliśmy wpływ różnych stężeń HDL na zakłócanie dimeru eNOS o 7-KC. Leczenie HDL chroniło zakłócenie poziomów dimeru eNOS w sposób zależny od stężenia w stężeniach między 25 a 100 .g / ml (Figura 7, A i B). Redukcja eNOS o 7-KC wymagała stosunkowo długiego czasu inkubacji (> 4 h) (Ryc. 7, C i D). Wcześniej opisywaliśmy specyficzną rolę ABCG1 w wypływie 7-oksysteroli (35). W celu dalszej oceny roli ABCG1 na poziomie dimerów eNOS, testowaliśmy działanie różnych oksysteroli i cholesterolu (każde 10 .g / ml) w podobnych eksperymentach. 7 (3-hydroksycholesterol oraz 7-KC istotnie zmniejszały poziomy dimeru eNOS (Figury 7, E i F). Leczenie HDL zapobiegało zaburzeniu dimeru eNOS 7A-hydroksycholesterolu. Cholesterol, 7 (3-hydroksycholesterol, 25-hydroksycholesterol lub 27-hydroksycholesterol nie wpływały na poziomy dimeru eNOS (Figura 7, E i F). Ten wzór dominujących efektów 7-oksysteroli na poziomach dimerów eNOS odpowiada specyficznej roli ABCG1 w promowaniu wypływu tych oksysteroli w porównaniu z innymi sterolami (35). Figura 7 Wpływ stężenia HDL, czas inkubacji z 7-KC, różne oksysterole i ekspresja ABCG1 na poziomach dimerów eNOS. (A i B) Wpływ stężenia HDL na zakłócenie dimeru eNOS o 7-KC. HAEC inkubowano z 7-KC (10. G / ml) i HDL (25. 200. G / ml) przez 16 godzin. (A) Western blot dla dimeru eNOS i monomeru. (B) Kwantyfikacja dimeru / monomeru eNOS. (C i D) Wpływ czasu inkubacji z 7-KC na zakłócenia dimeru eNOS. (C) Western blot dla dimeru eNOS i monomeru. (D) Oznaczanie ilościowe dimeru / monomeru eNOS. * P <0,05 w porównaniu z brakiem 7-KC w tym samym punkcie czasowym. (E i F) Wpływ różnych oksysteroli na rozerwanie dimeru eNOS. HAEC inkubowano z 10 .g / ml cholesterolu lub oksysteroli w obecności lub nieobecności HDL (100 .g / ml) przez 16 godzin. 7aOH, 7a-hydroksycholesterol; 7aOH, 7a-hydroksycholesterol; 25OH, 25-hydroksycholesterol; 27OH, 27-hydroksycholesterol. (E) Western blot dla dimeru eNOS i monomeru. (F) Oznaczanie ilościowe dimeru / monomeru eNOS. (G i H) HAEC transfekowano sfragmentowanym siRNA ABCG1, ABCA1 lub SR-BI. Czterdzieści osiem godzin po transfekcji HAEC inkubowano z 7-KC (10 .g / ml) w obecności lub nieobecności HDL (100 .g / ml) przez 16 godzin. (G) Western blot dla dimeru eNOS i monomeru. (H) Kwantyfikacja dimeru / monomeru eNOS. Wyniki są przedstawione jako średnie. SEM 3 indywidualnych eksperymentów. * P <0,05 względem kontroli. Aby ocenić specyficzną rolę ABCG1 w indukowanym przez 7-KCa rozerwaniu poziomów dimeru eNOS, znokautowaliśmy ekspresję ABCG1 przez siRNA. W HAEC transfekowanych ABCG1, ochronne działanie HDL zostało zniesione (Figura 7, G i H). Przeciwnie, supresja ani ABCA1 ani SR-BI nie wpłynęła na zdolność HDL do ochrony przed zakłóceniem poziomów dimeru eNOS o 7-KC (Figura 7, G i H). Te eksperymenty pokazują specyficzne zapotrzebowanie na ABCG1 na zdolność HDL do promowania wypływu 7-KC i do ochrony EC z dezakrem dimeru eNOS indukowanego przez 7-KC. Wpływ ABCG1 i HDL na produkcję ROS. Wcześniejsze badania wykazały, że zakłócenie poziomu dimerów eNOS może zależeć od peroksynitrytu (ONOO.), Który jest generowany z ponadtlenku (O2a) i NO (38). Aby zbadać hipotezę, że HDL i ABCG1 odwracają wpływ 7-KC na produkcję ROS, użyliśmy przepuszczalnego dla komórek odczynnika dioctanu 6-karboksy-2,7-dichlorodihydrofluoresceiny, estru diacetoksymetylowego (CM-H2DCFDA) (39) [hasła pokrewne: piramida żywieniowa dla dzieci, uzależnienie od leków przeciwbólowych, szczepionka na dur brzuszny ] [przypisy: transcendencja chomikuj, zgrubienie w pachwinie, rovamycyna ]