ABCG1 i HDL chronią przed dysfunkcją śródbłonka u myszy karmionych dietą bogatą w cholesterol ad 9

Co istotne, wykazano, że terapia niacyną polepsza relaksację naczyń w wyniku NO u ludzi. Nasze badania sugerują, że mechanizm leżący u podstaw może obejmować zwiększony wypływ cholesterolu i 7-oksysteroli przez szlak ABCA1 i ABCG1. Metody Materiały. Soczewka fluorescencyjna wrażliwa na ROS CM-H2DCFDA i szybko czerwona rakowa od Invitrogen. Przeciwciała anty-eNOS i anty-fosfo-eNOS (S1177) otrzymano z BD Transduction Laboratories. Przeciwciała anty-ABCG1, przeciw-PECAM i anty-nitrotyrinowe zakupiono od Abcam. Przeciwciało SR-BI pochodziło z Santa Cruz Biotechnology Inc. Przeciwciało anty-aktyna, X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo | -d-galaktopiranozyd), surowica z niedoborem lipoprotein, NAC, GSH, fenylefryna , ACh, SNP, cholesterol, 7-KC, 7a-hydroksycholesterol i 25-hydroksycholesterol zakupiono od Sigma-Aldrich. 27-Hydroksycholesterol otrzymano z Steraloids. L-NAME zakupiono od Cayman Chemical. Ludzką apoA-I uzyskano z Biodesign International. HDL (gęstość 1.063. 1.210 g / ml), HDL2 (gęstość 1.063. 1.125 g / ml) i HDL3 (gęstość 1.125. 1.210 g / ml) wyizolowano przez preparatywne ultrawirowanie z normolipidemicznego ludzkiego osocza i przechowywano w PBS. Badania na myszach. Abcgl. / ., Abca1. / ., i Abca1. /. Abcg1. /. myszy zostały wcześniej opisane (41). Przeprowadziliśmy badania z dietą chow (0,025% cholesterolu), HCD (1,25% cholesterolu, 7,5% masła kakaowego i 0,5% cholanu sodu, nr katalogowy TD88051, Harlan Teklad) i WTD (21% tłuszczu mleka, 0,2% cholesterol, nr katalogowy TD88137, Harlan Teklad). C57BL / 6 Ldlr. /. myszy i myszy AP47BL / 6 apoA-I Tg (63) otrzymano z Laboratorium Jacksona i skrzyżowano w celu wytworzenia myszy Ldlr + / aa ApoA-I Tg. Następnie, zwierzęta te krzyżowano z myszami DBA / 1LacJ (The Jackson Laboratory) w celu uzyskania genetycznie jednolitego pokolenia F1. Myszy F1 hybrydowe C57BL / 6 x DBA Ldlr + / ApoA-I Tg umieszczono na HCD. Zwierzęta miały dostęp ad libitum do żywności i wody. Protokoły na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee of Columbia University. Kolekcja tkanek. Myszy znieczulano przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy. Otwarto klatkę piersiową i jamę otrzewnową, a układ krążenia perfundowano przez lewą komorę PBS. Aorty usuwano i przetwarzano dla wszystkich testów. W badaniach naczyniowych lewą powierzchowną tętnicę udową usunięto i natychmiast umieszczono w lodowatym fizjologicznym roztworze soli. Badania funkcji naczyniowych. Tętnice udowe z nienaruszonym śródbłonkiem i podobnymi wymiarami zostały zamontowane na małym mykoptalerze drutu (Danish MyoTechnology), jak opisano wcześniej (53). Naczynia kąpano w fizjologicznym roztworze soli w 37 ° C i napowietrzano w sposób ciągły za pomocą 5% CO2 / 95% O2 dla uzyskania pH 7,4. Protokół uruchomienia i ocenę żywotności statku przeprowadzono zgodnie z wcześniejszym opisem (53). Krzywe odpowiedzi na stężenie wykonano dla ACh (zależnego od śródbłonka) i SNP (niezależny od śródbłonka czynnik uwalniający NO). Napięcie ścienne wyrażono jako mN / mm długości tętnicy. Wrażliwość na agonistę wyrażono jako log ujemny EC50 (. Log EC50). Czułość obliczano na podstawie krzywej odpowiedzi każdego stężenia, dopasowując równanie Hilla za pomocą Prism (GraphPad Software). Izolacja EC od aorty. Aorty myszy perfundowano PBS i trawiono w pożywce RPMI 1640 zawierającej kolagenazę D (2 mg / ml; Roche Applied Science) w 37 ° C przez 45 min. Trawienie sekwencyjnie przesączono przez sita komórek 100 | jm, 70 | jm i 40 | jM i przemyto PBS. Komórki inkubowano z przeciwciałem skoniugowanym z biotyną anty-PECAM (Millipore) w temperaturze 4 ° C przez 15 minut i przemyto PBS. Następnie komórki znakowano mikropereszkami streptawidynowymi (Miltenyi Biotec), a aorty EC rozdzielano za pomocą kolumny MACS (Miltenyi Biotec) zgodnie z instrukcjami producenta. Izolowane EC aorty stosowano do pomiaru masy steroli. Ekspresja LacZ i immunobarwienie PECAM. Tkanki zamrożono szybko w OCT i przechowywano w temperaturze <80 ° C. Przygotowano zamrożone sekcje o długości 10 urn. W celu określenia aktywności .-galaktozydazy szkiełka szklane inkubowano przez 16 godzin w obecności X-gal. Szkiełka były kontrastowo zabarwione jądrami szybko czerwonymi. Znakowanie immunologiczne PECAM przeprowadzono jak opisano wcześniej (64). Hodowlę komórkową. HAEC i pożywka hodowlana EMG-2 zakupiono od Lonza. Komórki hodowano w EMG-2 w 37 ° C w wilgotnym 5% CO2 i stosowano do doświadczeń pomiędzy pasażami 3 i 5. Wszystkie siRNA zakupiono od Invitrogen lub Santa Cruz Biotechnology Inc. HAEC transfekowano siRNA przy użyciu odczynnika RNA-MAX Lipofectamine (Invitrogen). ) zgodnie z protokołem producenta [patrz też: problemy z tarczycą objawy, coleus forskohlii opinie, uzależnienie od leków przeciwbólowych ] [przypisy: brak szczęścia w miłości, brzoskwinie wartości odżywcze, sennik karmienie piersią ]