Białko zapalne makrofagów 1 jako sygnał kostymulacyjny dla reakcji natychmiastowej nadwrażliwości z udziałem komórek tucznych ad 8

Jednocześnie, skoniugowany z wodorotlenkiem glinu (25 mg / oko) ekstrakt Fel d1 (200 jednostek / ml) podawano miejscowo do oka w dniach 1, 2, 3, 7 i 14. Następnie myszy poddano miejscowo ekspozycji na ekstrakt Fel d1. (200 AU / ml) bez ałunu raz w tygodniu. Osiem tygodni po początkowym uczuleniu, oczyszczony przez powinowactwo Fel d1 (0,5 mg / ml) wkroplono do mysich oczu (5 .l / oko) przez 3 kolejne dni do końcowego testu. W przypadku myszy C57BL / 6, ostateczne próby prowokowano w 10. tygodniu. Myszy kontrolne uczulano w podobny sposób, ale prowokowano stosując PBS zamiast roztworu antygenu. Specyficzność odpowiedzi potwierdzono przez prowokację uczulonych myszy z nieistotnym antygenem. Po ostatnim podejściu reakcje kliniczne rejestrowano w ciągu pierwszych 45 minut i oceniano za pomocą kryteriów opisanych w naszych poprzednich raportach, z modyfikacjami opisanymi tutaj (13, 16, 17, 35). Kryteria oceny, które wykorzystaliśmy przy określaniu wyników klinicznych, opierają się na dobrze ugruntowanych protokołach stosowanych przez nas i innych w klinicznych badaniach fazy II leków okulistycznych do alergii ocznej, w tym leków przeciwhistaminowych, cyklosporyny i FK506. Wszystkie oceniane objawy (obrzęk spojówek, obrzęk powiek / zaczerwienienie, łzawienie, mrużenie / mycie twarzy) odzwierciedlają charakterystyczne kategorie odpowiedzi zapalnej, wywołane przez wyraźny wkład mediatorów stanu zapalnego. Objawy oceniano metodą podwójnie ślepej próby przez zespoły 3. 4 osobników i oceniano od 0 do 4 przez okulistę nieświadomego tożsamości każdej myszy. Konkretnie, myszy umieszczono bez przeszkód po prowokacji alergenem w kapturku z przepływem laminarnym w warunkach oświetlenia otoczenia w celu oceny. Po pierwsze, ich reakcje behawioralne były rejestrowane w sposób ciągły między 10 a 15 minut po prowokacji, a ocena zezowania / mycia twarzy była oceniana na podstawie liczby ciągłych działań (stopień 0: brak, 1: 1. 2 s, 2: 3. 4 s 3: 4. 6 s, 4: 7 s lub więcej). Nagrywaliśmy wideo myszy, co pozwoliło na sprawdzenie krzyżowe tych wyników liczbowych. Inne objawy (obrzęk spojówek, obrzęk powiek / zaczerwienienie, łzawienie) oceniano 15 minut po prowokacji. Kryteria oceny były następujące: w przypadku obrzęku spojówkowego, 0: brak, 1: ogniskowy obrzęk spojówkowy, 2: obrzęk zamknięty w kwadrancie, 3: obrzęk dochodzący do 3 kwadrantów, 4: obrzęk w 4 kwadrantach; dla obrzęku powiek / zaczerwienienia, 0: brak, 1: nieznacznie zwężona bruzda powiekowa z przekrwieniem (szerokość trzech czwartych normalnej szczeliny), 2: zwężona bruzda powiekowa z obrzękiem (szerokość 2/3 normalnej bruzdki), 3: zwężona szczelina powiekowa z ciężkim obrzękiem (jedna trzecia szerokości normalnej szczeliny), 4: masywny obrzęk (rogówka ledwie widoczna); i do łzawienia, 0: minimalny poziom menisku łzy, 1: zwiększony poziom łez z wklęsłym łąkotkiem, 2: zwiększony poziom łez z wypukłym łąkotką, 3: bardzo zwiększony poziom łez z wydzieliną śluzową, 4: nadmierne łzawienie z obfitym wydzieliną. Skumulowany wynik kliniczny został obliczony jako suma wyników każdego z tych 4 parametrów (od 0 do 16). Szczegółowe kryteria oceny z zastosowaniem podobnego podejścia opisano również w naszym poprzednio opublikowanym sprawozdaniu (18). W celu oceny histologicznej natychmiastowych reakcji nadwrażliwości, myszy uśmiercono, a zebrane tkanki utrwalono w 4% paraformaldehydzie. Następnie zostały one wbudowane w Historesin (Leica Instruments GmbH), a seryjne sekcje strzałkowe (o grubości 3 .m) wybarwiono błękitem toluidynowym, Giemsa lub H & E. Zbadano trzy kolejne skrawki tkanki spojówki z każdego oka, a komórki tuczne zliczono pod mikroskopem polowym x 200 przez niezależnego naukowca w podwójnie ślepej próbie. MIP-1. blokada przez traktowanie przeciwciałem. Monoclonal MIP-1. przeciwciało (MAB450; R & D Systems) lub szczur kontrolny izotypu IgG (SouthernBiotech) podawano dożylnie za pomocą żyły ogonowej w dniach i 3 ostatniego tygodnia prowokacji godzinę przed prowokacją alergenem (łącznie 60 lub 200 .g / mysz). Działanie hamujące oceniono przez ocenę objawów klinicznych i analizę histologiczną degranulacji komórek tucznych. ELISA. Do oceny MIP-1. poziomy białka, oczy z przymocowanymi powiekami zebrano we wskazanych punktach czasowych po prowokacji Fel d1. Oczy usunięto przez wycięcie i wyizolowano izolowaną tkankę spojówki. Próbki zawieszono w PBS, poddano działaniu ultradźwięków na lodzie przez minutę przy użyciu Sonifier 450 (Branson) i sklarowano przez odwirowanie przy 10 000 g przez 15 minut. Sklarowane lizaty komórkowe badano pod kątem MIP-1. przy użyciu komercyjnego zestawu ELISA (R & D Systems). Czułość MIP-1. ELISA była mniejsza niż 1,5 pg / ml. Do pomiaru poziomów IgE, IgG1 lub IgG2a w surowicy myszy pobierano krew i po ostatecznym prowokacji antygenem pobierano surowicę.
[więcej w: sennik karmienie piersią, prostowanie keratynowe cennik, piramida żywieniowa dla dzieci ]
[patrz też: odkwaszanie organizmu cytryna, licówki porcelanowe cennik, balsam szostakowskiego zastosowanie ]