Hamowanie kalpain poprawia pamięć i transmisję synaptyczną w mysim modelu choroby Alzheimera ad 10

To stwierdzenie jest zgodne z naszą roboczą hipotezą, że umieszcza aktywację kalpainy w dół od A. wiąże się z komórkowymi celami i ostatecznie wpływa na fosforylację CREB (49). Chociaż nie wpływa to na całkowite A. poziomy, hamowanie kalpain może wywierać wartościowe działanie terapeutyczne w AD przez zablokowanie kaskad inicjowanych przez kalpain indukowanych przez oba A. i inne czynniki ryzyka AD, które zbiegają się na kalpach. Niemniej jednak doniesiono, że kalpany są zaangażowane w handel i pośrednio przetwarzanie APP (7. 11). Zmiany w rozpuszczalnej puli A. (60), w stanie skupienia niedonapitowanego A (3 lub w neuronowym A. pula (40, 61, 62), która nie mogła być wykryta ze względu na przyspieszony fenotyp myszy APP / PS1 zastosowanych w niniejszych doświadczeniach mogła również przyczynić się do korzystnego działania inhibitorów 2 kalpain. Zatem, zarówno raport E64 jak i BDA-410, który tu raportujemy, przedstawia potencjalnie ważny mechanizm do poprawy deficytów synaptycznych i pamięci wytwarzanych przez A .. Rola fizjologiczna kalpain może być źródłem niepokoju, ponieważ leki zmniejszają aktywność kalpain, ponieważ hamowanie może wpływać na fizjologiczne funkcje kalpain i powodować niepożądane efekty uboczne. Wydaje się to mniej prawdopodobne z uwagi na badania nad genetycznie zmodyfikowanymi myszami nadmiernie eksprymującymi inhibitor endogenny kalpastatynę, które wykazują prawidłowe składniki cytoszkieletu i markery synaptyczne, a także rozwój, płodność, morfologię, ruchliwość i długość życia w warunkach normalnych (63). Co najbardziej wymowne, nie zauważyliśmy wpływu E64 i BDA-410 na funkcje synaptyczne, zachowania poznawcze i lokomocję u myszy WT użytych w naszych eksperymentach. Rzeczywiście, kalpany prawdopodobnie rozszczepiają polipeptydy w ograniczonej liczbie miejsc, pozostawiając duże, często katalitycznie aktywne fragmenty (53). Zatem jest prawdopodobne, że kalpeny mają funkcję regulatorową lub sygnalizacyjną w komórkach, a nie funkcję trawienia, taką jak proteazy lizosomalne, a zatem niepożądane działania uboczne inhibitorów kalpainy mogą być ograniczone. Wyniki uzyskane w tych badaniach potwierdzają nową możliwą strategię terapeutyczną na AD w oparciu o modulujące działania kalpain. Rodzina proteaz kalpain stanowi system, który nie był jeszcze intensywnie wykorzystywany w terapii AD, chociaż zgromadzone dowody wspierają wczesną aktywację kalpain w podatnych regionach mózgu w AD (2, 64). Ponieważ zmiany synaptyczne są silnie skorelowane z nasileniem demencji klinicznej (59), można oczekiwać, że chroniąc przed uszkodzeniem synaptycznym przez inhibitory kalpainy można będzie zatrzymać lub spowolnić zaburzenia pamięci w AD i inne zaburzenia neurodegeneracyjne charakteryzujące się nieprawidłowym wytwarzaniem amyloidu. Metody Zwierzęta. Wszystkie eksperymenty zostały przeprowadzone za zgodą Komitetu ds. Pielęgnacji i Użytkowania Zwierząt Columbia University zgodnie z wytycznymi dotyczącymi humanitarnego traktowania zwierząt (NIH – Polityka Zdrowia Publicznego w zakresie opieki nad zwierzętami i użytkowania zwierząt laboratoryjnych, poprawiony w 2002 r.). Zwierzęta wykorzystywane do generowania hodowli komórkowych składały się z podwójnie transgenicznych myszy wyrażających zarówno ludzką mutację APP (K670N, M671L), jak i ludzką mutację PS1 (M146L) (linia 6.2), jak również ich współdziałające mioty WT. Zostały one uzyskane przez skrzyżowanie APP ze zwierzętami PS1. Aby zidentyfikować genotyp zwierząt, wykorzystaliśmy reakcję łańcuchową polimerazy na próbkach ogona pobranych po rozcięciu hipokampa (57, 65, 66). Hodowle komórkowe. Pierwotne hodowle przygotowano z jednodniowych młodych myszy (67). Komórki zdysocjowano przez obróbkę enzymatyczną (0,25% trypsyny), a następnie rozcieranie. Komórki hipokampa hodowano w pożywce zawierającej 84% MEM, uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą cielęcą, 45 mM glukozy, 1% roztworem witaminy MEM i 2 mM glutaminy. Po 24 godzinach pożywkę tę zastąpiono pożywką zawierającą 96,5% Neurobasal A, 2% B27-składnik odżywczy, 1% inaktywowaną termicznie płodową surowicą cielęcą, 0,4 mM glutaminą i 6,6 ng / ml 5-fluorodioksyurydyny w 16,4 ng / ml urydyny. tłumić podział komórek. Aby zapobiec indukcji plastyczności przez spontaniczną aktywność synaptyczną, kwas kynureninowy (0,5 mM) również był zawarty w pożywce hodowlanej. Immunocytochemia. Jak opisano wcześniej (51), hodowle inkubowano z 2 pierwszorzędowymi przeciwciałami przez noc w 4 ° C: mysia monoklonalna anty-kalpaina (rozcieńczona 1:50, Chemicon International) i oczyszczona przez powinowactwo królicza antysapsapsyna I (rozcieńczona 1: 200; Molekularne sondy). Przeciwciała wtórne były kozim anty-króliczym znakowanym czerwoną Rhodaminą i kozim anty-mysim, wyznakowanym Alexa Fluor 488 (rozcieńczonym 1: 500) w 4% surowicy koziej w PBS w temperaturze pokojowej przez godzinę. Wykrywanie fosforylacji CREB w plasterkach hipokampa przeprowadzono jak opisano wcześniej (patrz Metody dodatkowe) (20, 68). Analiza Western blot
[hasła pokrewne: szczepionka na dur brzuszny, chirurgia plastyczna szczecin, kawa rozpuszczalna skład ]
[więcej w: aerius dawkowanie, chrypka icd 10, trittico ulotka ]