Hamowanie kalpain poprawia pamięć i transmisję synaptyczną w mysim modelu choroby Alzheimera ad 11

W celu oceny cięcia kalpainy w hodowli komórkowej, pożywkę usunięto i przyłączone komórki przemyto dwukrotnie TBS / EDTA. Hodowane komórki następnie zbierano i homogenizowano w lodowatym buforze, składającym się z mM EGTA, 2 mM EDTA, mM DTT, 200 | ag / ml leupeptyny, 10 | ag / ml aprotyniny, mM PMSF, 2 | ag / ml DNAzy I, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4 i 150 mM NaCl. Ilości białek w próbkach określano za pomocą testu z kwasem bicynchoninowym (BCA). Równe ilości białka (25 .g) naniesiono na każdą ścieżkę żelu SDS / PAGE (4%, a 20% [wag./obj.] Akryloamidu), przepuszczono z systemem buforowym z tris-trycyną i przeniesiono na membranę PVDF z mokra elektrotransferowa jednostka. Bloty sondowano dla a-tubuliny jako wewnętrznej standardowej kontroli, usuwano i reprobowano anty-pektynę (1: 1000) (MAER1622 nieerytroid, Chemicon), a błonę eksponowano na skoniugowaną z alkaliczną fosfatazą anty-mysz (1: 7 500 ) przeciwciała wtórne. Detekcję przeprowadzono stosując chemiluminescencyjny substrat dla alkalicznej fosfatazy (gwiazda CDP) i ekspozycję błony na błonę rentgenowską. W celu oceny cięcia kalpainy spektrynami na myszach zwierzęta perfundowano PBS, a mózgi wycinano i homogenizowano w lodowatym buforze, składającym się z 1% SDS, mM EGTA, mM DTT, 10 (ag / ml aprotyniny, mM PMSF, 2 | ag / ml DNAzy I, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4 i 150 mM NaCl. Problem z tymi eksperymentami polega na tym, że kalpany ulegają hiperaktywacji podczas usuwania mózgu lub po jego usunięciu z powodu nieprawidłowego podwyższenia poziomu wapnia. Aby uniknąć tych problemów, aktywność kalpainy szybko zablokowano przez dodanie inhibitora kalpainy, leupeptyny (200 .g / ml) i chelatując wapń za pomocą EDTA (5 .M), przed homogenizowaniem tkanki. Próbki odwirowano przy 18 000 g przez 30 minut. Stężenia białka określono za pomocą zestawu do oznaczania białka BCA (Pierce). Równe ilości białka (15 .g) naniesiono na każdą ścieżkę żelu SDS / PAGE (gradient 4% 15%), przepuszczono przez układ buforu tris-glicynowego i przeniesiono na błonę nitrocelulozową. Bloty sondowano dla a-tubuliny jako wewnętrznej standardowej kontroli, oczyszczono i powtórnie strapsowano anty-spektriną (1: 1,000) (MAB1622, Chemicon) i membranę eksponowano na skoniugowaną z alkaliczną fosfatazą anty-mysz (1: 12,500 ) przeciwciała wtórne. Detekcję przeprowadzono stosując chemiluminescencyjny substrat dla alkalicznej fosfatazy (gwiazda CDP) i ekspozycję błony na błonę rentgenowską. W celu oceny pCREB w hodowlach, kultury przemyto dwukrotnie roztworem soli fizjologicznej. Komórki wystawiono na działanie glutaminianu (200
[więcej w: sennik karmienie piersią, kawa rozpuszczalna skład, operacja ścięgna achillesa ]
[hasła pokrewne: medicor rzeszow, xarelto apteka internetowa, transcendencja chomikuj ]