Hamowanie kalpain poprawia pamięć i transmisję synaptyczną w mysim modelu choroby Alzheimera ad 8

Western blot dla pCREB w Ser-133 z hodowanych neuronów hipokampa po 5-minutowym traktowaniu glutaminianem. Pięciodniowe hodowle traktowano nośnikiem, E64 lub BDA-410 przez 3 dni przed zastosowaniem glutaminianu. (B) Ilościowa analiza Western blot danych przedstawionych na poziomach A. pCREB w hodowlach WT traktowanych podłożem została zwiększona po glutaminianach (n = 11, P <0,01). Hodowle APP / PS1 nie wykazały wzrostu pCREB (n = 7; P> 0.01 z 1-drożną ANOVA). Jednak zarówno E64, jak i BDA-410 przywróciły normalne wartości pCREB (odpowiednio n = 5 i 8). E64 i BDA-410 nie wpłynęły na fosforylację w hodowlach WT (odpowiednio n = 5 i 7). Wszystkie próbki zostały znormalizowane względem a-tubuliny. (C) Przykłady plastrów hipokampa barwionych przeciwciałem pCREB i utrwalonych 60 minut po tężcowi u zwierząt WT i APP / PS1 traktowanych przez 5 miesięcy od 8 tygodnia życia E64, BDA-410 lub podłożem. Widok niższej mocy (oryginalne powiększenie, × 4) całego plasterka (lewy i środkowy panel). Widok wyższej mocy (oryginalne powiększenie, x 16) obszaru piramidalnego komórek CA1 (prawe panele). (D) Wykres przedstawiający blokadę wzrostu CA1-pCREB po tężcowi w plastrach APP / PS1 (n = 6 zarówno dla WT i APP / PS1, P <0,01), podczas gdy leczenie zarówno E64 jak i BDA-410 przez 5 miesięcy od 8 tygodnie ponownie przywróciły wzrost pCREB indukowany przez tężec (n = 6 dla obu; P <0,01 w porównaniu z tetanowanymi plasterkami z myszy APP / PS1 traktowanych nośnikiem). Zarówno E64, jak i BDA-410 nie miały wpływu na myszy WT po tężcowi (n = 6 dla obu). W przypadku braku t-burst ani E64, ani BDA-410 nie indukowały zmian myszy WT lub APP / PS1 (n = 4 dla każdej grupy, dane nie przedstawione). IF, immunofluorescencja. (E) Liczba immunoreaktywnych punktów synapsyny I była zwiększona w hodowlach APP / PS1 traktowanych podłożem (n = 6) w porównaniu z hodowlami WT traktowanymi podłożem (n = 6, P <0,01). Jednak podstawowa liczba immunoreaktywnych punktów synapsyny I była normalna po ekspozycji na E64 (n = 7) lub BDA-410 (n = 5). Inhibitory nie wpłynęły na immunoreaktywność synapsyny I w hodowlach WT (E64, n = 6, BDA-410, n = 7; P <0,01 w obu przypadkach w porównaniu z hodowlami APP / PS1 traktowanymi podłożem). (F) Glutaminian nie zdołał zwiększyć liczby immunoreaktywnych punktów synapsyny Ip w hodowlach APP / PS1 traktowanych podłożem (n = 8) w porównaniu z hodowlami WT traktowanymi podłożem (n = 7, P <0,01), podczas gdy zarówno E64 jak i BDA-410 ponownie ustanowił indukowany glutaminianem wzrost immunoreaktywności w hodowlach transgenicznych (E64, n = 9, BDA-410, n = 9, P <0,01 dla obu w porównaniu z hodowlami APP / PS1 traktowanymi podłożem). Zarówno E64, jak i BDA-410 nie miały wpływu na indukowany glutaminianem wzrost immunoreaktywności w hodowlach WT (E64, n = 9, BDA-410, n = 8). Hamowanie Calpain przywraca dystrybucję białka synaptycznego, synapsyny I. Hodowle komórkowe umożliwiają wizualizację zmian w rozkładzie białka synaptycznego podczas plastyczności. Stwierdzono, że glutaminian powoduje długotrwały wzrost liczby immunoreaktywnych klastrów lub punctów synapsyny białka synaptycznego I, jak również innych białek synaptycznych, takich jak synaptophysin, y-synukleina, GluR1 i PSD95, co sugeruje, że seria skoordynowanych zmian mikrostruktury w rozkładzie białka zachodzi na poziomie synaptycznym podczas plastyczności, w której redystrybucja synapsyny I jest integralnym składnikiem (51, 52). Ponadto, zgodnie z ustaleniami dotyczącymi zmian częstotliwości mEPSC w hodowlach APP / PS1, nadekspresję 2 transgenów powiązano ze wzrostem podstawowej liczby immunoreaktywnych punktów synapsyny I, wraz z blokiem indukowanego przez glutaminian wzrostu ich ilości. numer (32). Dlatego, w celu dalszego wyjaśnienia korzystnego wpływu inhibicji kalpain na poziomie synaptycznym, zbadaliśmy immunoreaktywność synapsiny I w hodowlach APP / PS1 w obecności inhibitorów kalpainy, zarówno w warunkach podstawowych, jak i plastyczności synaptycznej. Jak opisano poprzednio (32), stwierdziliśmy wzrost liczby immunoreaktywnych punktów synapsyny Ii w hodowlach APP / PS1 traktowanych podłożem w porównaniu z hodowlami WT traktowanymi zaróbką (Figura 5E) lub nietraktowanymi (dane nie przedstawione). Ekspozycja na E64 (1. M) lub BDA-410 (50 nM) przez 3. 4 dni przywróciła normalną liczbę immunoreaktywnych punktów synapsyny I. W hodowlach z myszy podwójnie transgenicznych (Figura 5E). Leczenie inhibitorami nie wpłynęło na poziomy immunoreaktywności synapsyny I w hodowlach WT (Figura 5E). Ponadto, gdy zbadaliśmy indukowany glutaminianem wzrost liczby immunoreaktywnych puncta (52) synapsyny I, stwierdziliśmy, że podanie aminokwasu pobudzającego (200 uM w 0 mg2 + soli fizjologicznej przez około minutę) nie zwiększyło liczby puncta w hodowlach APP / PS1 traktowanych podłożem, podczas gdy zwiększała liczbę punktów w hodowlach APP / PS1 traktowanych E64 i BDA-410p, jak również w hodowlach WT traktowanych podłożem (Figura 5F) i hodowlach kontrolnych, które nie otrzymać leczenie (dane nie przedstawione) [patrz też: samotne dziewczyny szukajace chłopaków, uzależnienie od leków przeciwbólowych, problemy z tarczycą objawy ] [przypisy: sennik karmienie piersią, prostowanie keratynowe cennik, problemy z tarczycą objawy ]