Hamowanie kalpain poprawia pamięć i transmisję synaptyczną w mysim modelu choroby Alzheimera ad

Dysocjowane kultury komórek hipokampa są szczególnie użytecznym modelem do badania podstawowej neurotransmisji i plastyczności synaptycznej. Hodowle komórkowe zwierząt transgenicznych wykazują wiele cech obserwowanych w AD, w tym wytwarzanie podwyższonych poziomów A. i dysfunkcja synaptyczna (32, 33). Tak więc, jako pierwsze narzędzie do naszych badań, wykorzystaliśmy preparaty do hodowli komórek hipokampa pochodzące od myszy APP / PS1 (34). Najpierw potwierdziliśmy wyniki dotyczące lokalizacji synaptycznej kalpain w kulturach neuronowych hipokampu (3). Immunoreaktywność Calpaina była obecna w ciałach komórek neuronalnych i była punktowana wzdłuż procesów neuronalnych (Figura 1A, lewy panel), gdzie kolokalizowano prawie całą immunoreaktywną punctą (Fig. 1A, prawy panel, żółty). Wyniki te są zgodne z koncepcją, że oba białka są zlokalizowane na poziomie synaptycznym. Regiony immunoreaktywności kalpainy, które nie były związane z synapsynami, mogą reprezentować lokalizacje, w których synapsa nie jest w pełni ukształtowana lub obszary, w których kaliny są zlokalizowane statystycznie. Figura Inhibitor kalpainy E64 przywrócił normalną funkcję synaptyczną w hodowlach hipokampowych myszy APP / PS1. (A) Immunoreaktywność Calpaina colocalized immunofluorescence dla białka presynaptycznego, immunoreaktywna puncta synapsin I. Calpain (lewy panel). Immunoreaktywna punkcja synapsiny I (środkowy panel). Kolokalizacja immunoprzeciwaktywnych punktów kalpainy za pomocą immunoreaktywnych punktów synapsyny I (tak, że punkty wyglądają na żółte) (prawy panel). Pasek skali: 15 .m. (B) Analiza Western blot wykazała, że E64 anulował cięcie kalpainy dla spektryny do jej fragmentu 150 kDa (n = 5 na grupę). (C) Ilościowa analiza western błot fragmentu o 150 kDa wykazała wzrost o 32% w hodowlach APP / PS1 w porównaniu z hodowlami WT (n = 5 dla obu, P <0,05, dane znormalizowane względem a-tubuliny). (D) Hodowle APP / PS1 traktowane podłożem (traktowane veh) wykazywały w przybliżeniu 2-krotny wzrost spontanicznej częstotliwości mEPSC (n = 10) w porównaniu z hodowlami WT traktowanymi podłożem (n = 10, P <0,01, z jednokierunkowym ANOVA). E64 nie wpływał na średnią podstawową częstość mEPSC w hodowlach WT (n = 10; P> 0,05 z t testem), ale przywracała normalną podstawową częstotliwość spontanicznego uwalniania neuroprzekaźnika w hodowlach APP / PS1 (n = 6). (E) Zastosowanie glutaminianu nie zwiększa już częstości występowania mEPSC w hodowlach z myszy APP / PS1 traktowanych podłożem w porównaniu z hodowlami z myszy WT traktowanych podłożem (n = 10 w hodowlach APP / PS1, n = 10 w hodowlach z miotu WT P; 0,01 z 2-drożną ANOVA) bez wpływu na amplitudę mEPSC w żadnym z genotypów (dane nie przedstawione). Blok aktywności kalpainy poprzez E64 poprawił niedobór długotrwałego wzmocnienia transmisji synaptycznej (n = 10, P <0,01 w porównaniu z hodowlami APP / PS1 traktowanymi podłożem), bez wpływu na to w hodowlach WT (n = 10, P> 0,05 w porównaniu z hodowlami WT traktowanymi podłożem). Następnie zbadaliśmy, czy kalpeny odgrywają rolę w przekaźnictwie nerwowym przy użyciu inhibitora proteazy cysteinowej E64. E64 jest nieodwracalnym, przepuszczalnym dla komórek i tkanki inhibitorem kalpainy i kalpainy 2. Jest to peptydomimetyk Arg-Leu z elektrofilową głowicą epoksydową, która nieodwracalnie modyfikuje cysteinę z miejsca aktywnego i był stosowany w wielu badaniach jako inhibitor cysteiny proteazy, takie jak kalpaina (IC50 = 0,57. 0,01. M) (35. 37). We wstępnych eksperymentach potwierdzono, że E64 hamuje cięcie kalpainy w spektrum do jej fragmentu 150 kDa w hodowlach neuronalnych, co jest cechą charakterystyczną działania kalpainy (Figura 1B) (22). Co ciekawe, poziomy fragmentu spektroskopu generowanego przez kalpainę o 150 kDa były zwiększone w hodowlach komórek myszy APP / PS1 w porównaniu z hodowlami WT, co sugeruje, że kalpiny są nadaktywowane w hodowlach neuronalnych myszy transgenicznych (Figura 1C). Zdrowe neurony spontanicznie uwalniają neuroprzekaźnik, zjawisko znane jako miniaturowe poboczne prądy postsynaptyczne (mEPSC). Analiza częstotliwości i amplitudy mEPSC w 11 do 14-dniowych hodowanych neuronach myszy WT nie ujawniła żadnej różnicy między hodowlami traktowanymi podłożem, tymi, które traktowano E64 (1 (M) przez 3. 4 dni (Figura 1D) lub hodowle kontrolne, które nie otrzymały żadnego leczenia (dodatkowa postać 1A, materiał uzupełniający dostępny online z tym artykułem; doi: 10.1172 / JCI34254DS1). Wyniki te sugerują, że kalpeny nie odgrywają roli w spontanicznym uwalnianiu neuroprzekaźnika. Stwierdzono znaczny wzrost podstawowej częstotliwości mEPSC w hodowlach traktowanych podłożem ze zwierząt APP / PS1 (Figura 1D). Natomiast średnia amplituda mEPSC pozostała niezmieniona. W przeplatanych eksperymentach, zastosowanie E64 (1.M) do pożywki hodowlanej przez 3-4 dni przywróciło normalną podstawową częstotliwość spontanicznego uwalniania neuroprzekaźnika u myszy APP / PS1 (Figura 1D) bez zmiany średniej amplitudy
[podobne: brzoskwinie wartości odżywcze, szczepionka na dur brzuszny, problemy z tarczycą objawy ]
[patrz też: chrypka icd 10, trittico ulotka, medicor rzeszow ]