Hsp104 antagonizuje agregację a-synukleiny i zmniejsza degenerację dopaminergiczną w szczurzym modelu choroby Parkinsona ad 10

Liczenie prowadzono do momentu zniknięcia pars reticulata, co wykluczało jądro zrogowłosenia. Sekcje użyte do kwantyfikacji obejmowały całą substancję czarną od wierzchołka wierzchołka pars compacta z powrotem do ogonowego końca pars reticulata. Co istotne, nie zaobserwowano znaczącej różnicy w szacowanej objętości istoty czarnej przy użyciu zasady Cavalieri lub wielkości ciałek komórkowych zliczonych neuronów w obrębie grup eksperymentalnych (strona bez iniekcji w porównaniu z wtłaczaną) lub między grupami eksperymentalnymi. Aby określić gęstość terminali TH-IR, włókna prążkowia wybarwiono na TH za pomocą zestawu ABC (Vector Laboratories), a odpowiednie gęstości optyczne oszacowano za pomocą oprogramowania NIH IMAGE 1.4 (http://rsbweb.nih.gov/nih- image /) (18, 42). W przypadku liczby neuronów zawierających fosforylowane inkluzje a -syny, 5 sekcji w istocie czarnej barwiono za pomocą Pser129 Ab metodą kompleksu awidyna-biotyna. Statystyka. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą jednokierunkowej ANOVA, a następnie testu post-hoc chronionego co najmniej znaczącą różnicą Schefféssa (Statistica 5.1, Statsoft Inc.). Poziom istotności ustalono na poziomie P <0,05. Białka. plazmidy do ekspresji plazmidu. -syna zostały dostarczone przez P. Lansbury (Brigham and Women. s Hospital i Harvard Medical School, Cambridge, Massachusetts, USA). białka a -syny (typ dziki, A53T, A30P, E46K, S129A i S129E) oczyszczono jak opisano (20). Hsp104 i Hsp104K218T: K620T oczyszczono jak opisano (33). Stężenia Hsp104 odnoszą się do heksamerycznego Hsp104. Hsc70, Hsp70, Hdj1 i Hdj2 pochodziły z Alexis Biochemicals. P-synylowanie prestyloidalne oligomery i demontaż. Pretyloidowe oligomery a-syna A30P oczyszczono przez filtrację żelową (15). W eksperymentach z demontażem, oligomery preamylotyczne A30P (0,5. M monomer) inkubowano z Hsp104 lub Hsp104K218T: K620T (10. M) w buforze KHM (40 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 150 mM KCl, 20 mM MgCl2, mM DTT) plus ATP (10 mM) i system regeneracji ATP (20 mM fosforan kreatyny i 0,001 mg / ml kinazy kreatynowej) przez godzinę w 37 ° C. Reakcje przetwarzano dla dot blot (33) i sondowano anty-oligomerowym Ab (dostarczonym przez C. Glabe, University of California, Irvine, Irvine, California, USA) (14) lub anty-syn Ab (BD Biosciences ). Alternatywnie, reakcje poddano wymianie buforu stosując kolumny wirujące Bio-Gel P-6 do 40 mM HEPES-KOH, pH 7,4, 150 mM KCl i 20 mM NaEDTA, rozcieńczono 5-krotnie i inkubowano przez 10 minut w 25 ° C w celu dezasemblacji Hsp104. heksamery i poddane obróbce pod kątem ujemnego wybarwienia EM (33). Inne reakcje zostały zubożone w Hsp104, jak opisano (33), a następnie frakcjonowane przez filtr Microcon YM-100 (100-kDa odcięcia masy cząsteczkowej) (Milllipore). Frakcje retentatu i przesączu wytrącano TCA i przetwarzano na SDS-PAGE, a następnie barwił Coomassie Brilliant Blue. montaż i demontaż włókien światłowodowych. W przypadku reakcji fibrylizacji białka y -syny (80 | jM) inkubowano w KHM plus ATP (10 mM) i systemie regeneracji plus lub minus Hsp104 lub Hsp104K218T: K620T (0. 1,6. M) przez 0. 48 godzin w 37 ° C , z obrotem (80 rpm) na Mini-rotatorze (Glas-Col). Co 8 godzin reakcje były uzupełniane świeżym systemem regeneracji w celu utrzymania poziomów ATP. W przypadku reakcji demontażu, włókna a-synów (0,5. M monomer) inkubowano w KHM plus ATP (10. M) i systemie regeneracji plus lub minus Hsp104 lub Hsp104K218T: K620T (10. M) w obecności lub nieobecności wskazanych kombinacji Hsp70, Hsc70, Hdjl i Hdj2 (10 (M) przez godzinę w 37 ° C. W reakcjach zawierających AMP-PNP (1 mM) pominięto system regeneracji. Montaż lub demontaż włókien oznaczono metodą fluorescencji ThT, analizy sedymentacyjnej, zmętnienia lub EM (8, 33). Do fluorescencji ThT dodano ThT w 50 mM glicyny (pH 8,5), aby uzyskać końcowe stężenia a-synów (0,25 jiM) i ThT (10 jiM). Fluorescencję przy 480 nm zmierzono po wzbudzeniu przy 450 nm. W celu analizy sedymentacji, reakcje odwirowano przy 436 000 g przez 10 minut w 25 ° C. Supernatant i frakcje peletek następnie rozdzielono przez SDS-PAGE i wybarwiono Coomassie Brilliant Blue. Procent a -syny w osadzie określano przez densytometrię i porównanie ze znanymi ilościami a -syny. Mętność monitorowano za pomocą absorbancji przy 395 nm. Podziękowania Dziękujemy D. Picard, P. Lansbury i C. Glabe za hojne dostarczanie odczynników; P. Colin, C. Sadeghi i M. Rey za doskonałą pomoc techniczną; A. Gitler za komentarze do rękopisu C. Lo Bianco był wspierany przez Fundację Michaela J. Foxa, Europejską Organizację Biologii Molekularnej, Szwedzką Fundację Parkinsona i Szwajcarską Narodową Fundację Naukową. J. Shorter był wspierany przez grant naukowy American Heart Association Scientist Development Grant, University of Pennsylvania Institute on Aging oraz nagrodę NIH Director s New Innovator Award (DP2OD002177). P. Aebischer był wspierany przez Fundację Michaela J. Foxa i Szwajcarską Narodową Fundację Naukową. Przypisy Niestandardowe skróty: PD, choroba Parkinsona; P-syn, P-synukleina; TH, hydroksylaza tyrozynowa; TH-IR, immunoreaktywny TH; ThT, tioflawina-T; YFP, żółte białko fluorescencyjne. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. Informacje referencyjne: J. Clin. Invest.118: 3087. 3097 (2008). doi: 10.1172 / JCI35781 Obecny adres Etienne Régulier to: Novartis Pharma AG, Target and Lead Discovery Unit, CHBS, Bazylea, Szwajcaria. Christophe Lo Bianco i James Shorter w równym stopniu przyczynili się do tej pracy. [patrz też: hydrominum skutki uboczne, coleus forskohlii opinie, prostowanie keratynowe cennik ] [hasła pokrewne: pęknięcie pierścienia włóknistego, operacja ścięgna achillesa, piramida żywieniowa dla dzieci ]