Hsp104 antagonizuje agregację a-synukleiny i zmniejsza degenerację dopaminergiczną w szczurzym modelu choroby Parkinsona ad 5

Istota czarna zwierząt z nadekspresją A30P / YFP lub A30P / Hsp104 ujawnia obecność hiperfosforylowanych inkluzji przypominających ciałka Lewy ego. Pasek skali: 300 .m (A = F); 40 (m (GjI); 50 m (J. L). (M) Ocena ilościowa neuronów zawierających agregaty pozytywne Pser129 w istocie czarnej szczurów eksprymujących A30P / YFP lub A30P / Hsp104. Wartości reprezentują średnią. SEM; n = 6 zwierząt na grupę; P <0,05. Aby jaśniej ocenić, czy Hsp104 wpływał na agregację. -Syny in vivo, ocenialiśmy fosforylowane inkluzje a -syny. a-syna fosforylowana głównie w serynie 129 selektywnie i obficie kumuluje się w obu ciałach Lewy pacjentów PD i wtrąceniach a-zwierzęcych modeli zwierzęcych (13, 18, 21). Dlatego też, ilościowo określiliśmy liczbę fosforylowanych wtrąceń z specyficznym dla Pser129 Ab dla fosforylowanego y -syny przy serynie 129 (18, 21) (Figura 4, J (M)). Jak opisano poprzednio (18), ekspresja A30Py-Ssyn prowadzi do tworzenia fosforylowanych inkluzji (figura 4K) w porównaniu z zwierzętami bez iniekcji (Figura 4J). Co uderzające, koekspresja Hsp104 z A30Py-syn spowodowała zmniejszenie o 57% liczby neuronów zawierających inkluzje fosforylowane (Figura 4, L i M), wskazując, że Hsp104 może chronić komórki dopaminergiczne przez zmniejszenie liczby fosforylowanych agregatów a-sin. . Hsp104 hamuje a-syzylogenezę. Z naszych doświadczeń in vivo trudno jest odróżnić, czy Hsp104 zapobiega agregacji a -syny lub resolubilizacji a -syny po jej agregacji. W związku z tym ustaliliśmy, w jaki sposób Hsp104 wpływa na ~ -ynową amyloidogenezę in vitro, stosując czyste białka. In vitro, oczyszczony a -syny składa się we włókna, które są bardzo podobne do filamentów y-synów wyizolowanych od pacjentów z synukleinopatią (9, 10). y -syyn złożony w włókna amyloidowe po opóźnieniu wynoszącym w przybliżeniu 5 godzin inkubacji i składanie było praktycznie zakończone po około 24 godzinach, jak oceniono za pomocą fluorescencji ThT (diagnostyczny barwnik amyloidowy) (Figura 5A) i analizy sedymentacyjnej (Figura 5B). Gdy dodawano Hsp104 na poziomach substechiometrycznych (monomery a-syryny / heksamery Hsp104, 80: 0,2 (M), opóźniano fibrylizację (Figura 5, A i B). Niezwykle, wyższe stężenia Hsp104 (monomery a-syny / heksamery Hsp104, 80: 0,8 (M lub 80: 1,6 (M)) pozwoliły na bardzo małą fibrylizację po 48 godzinach (Figura 5, A i B). Badanie EM potwierdziło, że Hsp104 hamował fibrylizację (3-yynową (Figura 5C). Bezpostaciowy materiał nagromadzony w obecności Hsp104 (rysunek 5C). Hamowanie fibrylizacji P-a przez Hsp104 było stabilne do około 72 godzin (dane nie pokazane). Po 96 godzinach, Hsp104 zaczęło tracić aktywność i mogła zaistnieć pewna fibrylizacja (3 -syna (Figura 5D). Jednakże, jeśli reakcje uzupełniono dodatkowym Hsp104 po 72 godzinach, utrzymywano hamowanie fibrylizacji (3-yynowej (Figura 5D). Zatem zahamowanie fibrylizacji a-S jest stabilne, pod warunkiem, że istnieje odnawialne źródło aktywnego Hsp104. Figura 5Hsp104 hamuje fibrylizację a-synów. (A i B) Kinetyka obróconej (80 rpm) fibrylizacji a-synów (80 uM) w 37 ° C bez lub z Hsp104 (0,2. 1,6. M) plus ATP i układ regeneracji (20 mM fosforan kreatyny i 0,1 mg / ml kinazy kreatynowej), Hsp104 (0,2. M) bez nukleotydu, Hsp104 (0,2. M) plus niezhydrolizowalny analog ATP (AMP-PNP) lub Hsp104K218T: K620T (0,2. M) plus ATP i system regeneracji. Fibrylowanie mierzono fluorescencją ThT (A) lub analizą sedymentacyjną (B). Wartości reprezentują średnią. SD; n = 3. (C) EM z fibrylizacją a-synów (80 | jM) w 37 ° C przez 48 godzin bez Hsp104 (1,6 | M) plus z ATP i układem regeneracji lub z tym środkiem. Pasek skali: 200 nm. (D) P-syn (80 (M) inkubowano przez 96 godzin z rotacją w 37 ° C w obecności lub nieobecności Hsp104 (1,6 | M) plus ATP i system regeneracji. Po 72 godzinach reakcje uzupełniono buforem lub świeżym Hsp104 (1,6. M). Fibrylowanie mierzono fluorescencją ThT. Wartości reprezentują średnią. SD; n = 3. (E) Kinetyka fibrylizacji typu dzikiego, A53T, A30P, E46K, S129A i S129E -syny (80 (M) w obecności lub nieobecności Hsp104 (2 (M) plus ATP i system regeneracji. Kolejna reakcja zawierała A53T (80 .M) plus Hsp104 (4 .M) z ATP i układem regeneracji. Reakcje obracano (80 rpm) w 37 ° C. Fibrylowanie mierzono fluorescencją ThT. Wartości reprezentują średnią. SD; n = 4. Hsp104 dawało małe hamowanie fibrylizacji a-synów w nieobecności ATP, a hamowanie było zmniejszone przez obecność niehydrolizowalnego analogu ATP, AMP-PNP (Figura 5A). Zastosowaliśmy również mutacje przenoszące Hsp104 w wysoce konserwatywnych motywach Walker A obu domen ATA typu AAA +, Hsp104K218T: K620T, który jest uszkodzony w wiązaniu ATP i hydrolizie w obu miejscach (49) [podobne: chirurgia plastyczna szczecin, przychodnia władysławowo, xarelto apteka internetowa ] [podobne: xarelto apteka internetowa, transcendencja chomikuj, zgrubienie w pachwinie ]