Hsp104 antagonizuje agregację a-synukleiny i zmniejsza degenerację dopaminergiczną w szczurzym modelu choroby Parkinsona ad 6

Mutant nie hamował fibrylizacji. Zatem maksymalne zahamowanie fibrylizacji P-synów wymaga wiązania ATP i hydrolizy przez Hsp104. Następnie testowaliśmy, czy Hsp104 może hamować fibrylizację połączonych przez PD wariantów a-synów, w tym A30P, A53T i E46K. A53T i E46K łączą się z włóknami amyloidowymi szybciej niż typu dzikiego typu. -Syn, podczas gdy A30P uzyskuje dostęp do preamonoidalnych oligomerów szybciej niż typ dziki, ale zajmuje dłużej tworzenie włókien (7, 19). Hsp104 hamował fibrylizację A53T we wczesnych okresach, ale to hamowanie zostało przezwyciężone przez 48 godzin inkubacji (Figura 5E). Stabilne hamowanie A53T w ciągu 48 godzin wymagało wyższych stężeń Hsp104 (Figura 5E), być może dlatego, że A53T gromadził się szybciej niż jakikolwiek inny z wariantów y-sin. W przeciwieństwie do tego, Hsp104 hamował fibrylizację przez A30P i E46K tak samo dobrze jak dziki -yyn typu dzikiego (Figura 5E). Tak więc, Hsp104 silnie hamuje łączenie spektrum mutantów P-sprzężonych z PD. U pacjentów z synukleinopatią, y -syna jest fosforylowana na serynie 129, co może stymulować fibrylizację (3-syrynową (21). Stwierdziliśmy, że Hsp104 hamuje fibrylizację obu. -Syny S129A, które nie mogą być fosforylowane w pozycji 129, i S129E, które mogą naśladować a-synfosforylowane w S129 (Figura 5E). Dlatego zmniejszenie fosforylowanych inkluzji A30Py-S zaobserwowanych in vivo prawdopodobnie wynika, przynajmniej częściowo, z hamowania ich składania przez Hsp104. Hsp104 przebudowuje oligomery preamyloidalne A-sin A30P. Preamyloidalne oligomery mogą być bardziej cytotoksycznymi gatunkami w wielu neurodegeneracyjnych skrobiawicach, w tym synukleinopatiach (14, 50). Ponadto, są one prawdopodobnie ważnymi związkami pośrednimi w procesie fibrylizacji (8, 15, 33, 34). W ten sposób ustaliliśmy, czy Hsp104 może przebudować preformowane oligomery preamylotyczne A30P. Oligomery preamylotyczne A30P zostały utworzone i oczyszczone z monomerów za pomocą filtracji żelowej (15). Oczyszczone oligomery preamylotyczne A30P są trwałe przez długi czas (~ 10 dni) i nie dysocjują na monomery lub dimery (15). Jednakże, w celu zapewnienia, że nasz materiał wyjściowy był w 100% oligomeryczny, oczyszczone oligomery preamylotyczne A30P traktowano natychmiast Hsp104 lub Hsp104K218T: K620T. Hsp104K218T: K620T nie był zdolny do przebudowy oligomerów preamloidalnych A30P, co określono przez immunoreaktywność anty-oligomerową, EM i retencję przez filtr 100 kDa (Figura 6). Przeciwnie, Hsp104 zmniejszył immunoreaktywność anty-oligomerową (Figura 6A), a EM ujawnił, że Hsp104 zdemontował oligomery preamonoloidu A30P (Figura 6B). A30P był teraz w stanie przejść przez filtr 100 kDa (rysunek 6, C i D). W ten sposób Hsp104 eliminuje oligomery p-prenyloalkilu A30P, które są potencjalnie najbardziej toksycznymi gatunkami, które powstają podczas amyloidogenezy A30P (14). Figura 6Hsp104 modyfikuje preambury oligomery ami-Ayn A30P. (A (D) Oczyszczone oligomery p-syl A30P-preamyloidalne (0,5 .M) inkubowano bez lub z Hsp104 lub Hsp104K218T: K620T (10 .M) plus ATP i układ regeneracji przez godzinę w 37 ° C. Reakcje zauważono na nitrocelulozie i sondowano anty-oligomerem Ab lub anty – syn Ab (A). (B) Alternatywnie, reakcje przetwarzano dla EM (podziałka skali: 25 nm) lub (C) zubożonego w Hsp104 i przepuszczano przez filtr o masie cząsteczkowej 100 kDa. (C i D) Frakcje retentatu i przesączu zebrano i analizowano metodą SDS-PAGE, a ilość A30P w przesączu oznaczono metodą densytometrii. Wartości reprezentują średnią. SD; n = 4 (D). Hsp104 modyfikuje włókna. -Synowe. W końcu, przetestowaliśmy, czy przebudowane włókna Hsp104 utworzone przez dzikiego typu a -syna, jak również zmutowane przez PD mutanty A30P, A53T i E46K i mutanty seryny 129 S129A i S129E. Co godne uwagi, Hsp104 zdemontował włókna złożone z dzikiego typu a-synów, A53T, A30P i S129A, jak ujawniono za pomocą fluorescencji ThT (Figura 7A) i zmętnienia (Figura 7B). Spośród nich A30P był najbardziej podatny na demontaż przez Hsp104 (Figura 7, ACH). Wymagało to hydrolizy ATP przez Hsp104 i nie było obserwowane przy Hsp104K218T: K620T lub w obecności AMP-PNP (Figura 7, A i B). Intrygujące, włókna S129E były bardziej odporne na demontaż przez Hsp104, a włókna E46K były ogniotrwałe dla Hsp104. Podsumowując, dane te sugerują, że Hsp104 rozkłada włókna składające się z p-synów typu dzikiego i niektórych wariantów P-sprzężonych y. Figura 7Hsp104 przebudowuje włókna -yynowe. (A i B) Włókna złożone z typu dzikiego, A53T, A30P, E46K, S129A lub S129E-Ssyn (0,5 mM monomer) inkubowano z Hsp104K218T: K620T, Hsp104 (10 (M) plus ATP i układem regeneracji, lub System AMP-PNP przez godzinę w 37 ° C. Integralność włókien została określona przez fluorescencję ThT (A) lub zmętnienie (B)
[hasła pokrewne: odkwaszanie organizmu cytryna, samotne dziewczyny szukajace chłopaków, ciekawe aplikacje na telefon ]
[hasła pokrewne: rovamycyna, ultramedica kraków, pokrzywka icd 10 ]