Hsp104 antagonizuje agregację a-synukleiny i zmniejsza degenerację dopaminergiczną w szczurzym modelu choroby Parkinsona ad 9

Zdolność Hsp104 do zapobiegania i odwrotnej agregacji białek patogennych należy uznać za potencjalną strategię leczenia lub odwracania chorób PD i innych agregacji białek. Jednak dalsze badania są wymagane do oceny bezpieczeństwa długotrwałej ekspresji Hsp104 w neuronach. Metody Wektory lentiwirusowe. cDNA kodujący YFP zlokalizowany w jądrach (BD Biosciences. Clontech), ludzki P-syn A30P i Hsp104 (należycie dostarczone przez D. Picarda, Département de Biologie Cellulaire, Université de Gen. ve, Gen. ve, Szwajcaria) sklonowano w wektor lentiwirusowego przeniesienia SIN-W-PGK i cząsteczki wirusa (lenti-YFP, lenti-A30P i lenti-Hsp104) wytworzono jak opisano (42, 67). Zawiesiny wirusa lenti-A30P / lenti-YFP i lenti-A30P / lenti-Hsp104 wytworzono przez zmieszanie wirusów w stosunku 1: (18). Zawartość cząstek była dopasowana do 180 000 ng p24 / ml dla każdego wektora lentiwirusowego (18). Wstrzyknięcie stereotaktyczne. Wektory lentiwirusowe wstrzykiwano stereotaktycznie w prawej istocie czarnej dorosłych samic szczurów Wistar (Iffa-Credo) o wadze 200 g. Zawiesiny wirusa wstrzyknięto w 2 miejscach strzykawką Hamiltona o masie 10 jj.1 z szybkością 0,2 l / min z automatycznym iniektorem (Stoelting Co.), a igłę pozostawiono na miejscu na dodatkowe 10 minut przed pobraniem. Wstrzyknięcia stereotaktyczne przeprowadzono w 2 miejscach (2,5 .l na miejsce) z współrzędnymi przednimi, bocznymi i brzusznymi (4,8, 2, 7,7 i 5,5, 1,7, 7,7), jak opisano (18, 42). Zwierzęta uśmiercano w 6 tygodniu po wstrzyknięciu. Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z dyrektywą Rady Wspólnoty Europejskiej (86/609 / EWG) dotyczącą opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych. Eksperymenty opisane w tym artykule zostały zatwierdzone przez Urząd ds. Weterynarii, a także przez Komisję Doświadczenia na Zwierzętach w Kantonie Vaud (Szwajcaria) i zostały przeprowadzone na podstawie licencji dla zwierząt 1653. Immunohistochemia. Zwierzęta głęboko znieczulono pentobarbitalem sodu i perfundowano przezsercowo 4% paraformaldehydem. Mózgi usunięto i ponownie utrwalono w 4% paraformaldehydzie na około 24 godziny, zamrożono kriogenicznie w 25% sacharozie w 0,1 M buforze fosforanowym na 48 godzin i przetworzono jak opisano (18, 42). Użyto następujących pierwszorzędowych Ab: Ab owczego TH (1: 500, Pel-Freez Biologicals), RG syn-syn poliklonalnego królika Ab (1: 400, odnośnik 42), ludzkiego monoklonalnego Ab LB509 ludzkiego. -Syła (1: 500; Zymed), Ab Pser129 specyficznie rozpoznający ufosforylowane Ser 129 z Psy12 (1: 100, odnośnik 21) i królicze Ab do C-końca Hsp104 (1: 800; Stressgen). W przypadku mikroskopii świetlnej skrawki barwiono klasyczną metodą kompleksu avidyna-biotyna, jak opisano (42). W przypadku wielokrotnego znakowania fluorescencyjnego drugorzędowe Ab sprzężone z Cy3 (osioł anty-owcy) i Cy5 (osioł przeciw-mysie) pochodziły z Jackson ImmunoResearch Laboratories. Ekspresję Hsp104 ujawniono za pomocą systemu fluoresceiny TSA (PerkinElmer Life Sciences). Skrawki następnie analizowano za pomocą mikroskopii konfokalnej (Leica TCS SP2 AOBS). Wykonywano wybarwianie srebra w celu wykrycia neuronów degenerujących się w sekcjach utrwalonych w paraformaldehydzie (18, 47). Zestaw FD NeuroSilver stosowano zgodnie z protokołem producenta (FD Neuro-Technologies). Liczenie komórek i gęstość włókien TH. Aby określić procent utraty komórek TH-IR w istocie czarnej, 9. 10 przekrojów wieńcowych o grubości 40. M na zwierzę zostało zabarwionych immunofluorescencyjnie dla markera TH. Wszystkie neurony TH-IR zliczono we wstrzykniętej i bez iniekcji stronie istoty czarnej, a wyniki wyrażono jako procent strat komórek TH-IR w stosunku do strony bez iniekcji (18, 42, 67). Granice istoty czarnej określano w osi rufrocudnej za pomocą anatomicznych punktów orientacyjnych w atlasie mózgu szczura (68). Ponieważ wyznaczenie granic między brzusznym obszarem nakrywkowym (VTA) (A10), jądrem poporowym (A8) i substancją ciemiączkową (A9) nie jest jasne, granica przyśrodkowa między VTA i substancją czarną została określona linią pionową przechodzenie przez środkową końcówkę szypuły mózgowej (i przez przyśrodkowe końcowe jądro dodatkowego jądra układu nerwowego, gdy występuje w sekcjach), tym samym wyłączając komórki TH-IR w VTA. Boczna granica podążyła za grzbietową krawędzią szypułki mózgowej, tym samym włączając komórki TH-IR w pars reticulata, a obszar rozszerzony poprzecznie, aby uwzględnić pars lateralis oprócz pars compacta
[więcej w: coleus forskohlii opinie, hydrominum skutki uboczne, ciekawe aplikacje na telefon ]
[hasła pokrewne: lendacin, medispirant żel pod prysznic opinie, femoston mini ]