Hsp104 antagonizuje agregację a-synukleiny i zmniejsza degenerację dopaminergiczną w szczurzym modelu choroby Parkinsona cd

Ponieważ Hsp104 nie ma ogólnego działania przeciwapoptotycznego (np. W odpowiedzi na staurosporynę lub nadtlenek wodoru) po ekspresji w komórkach ssaków (43), jakiekolwiek zmniejszenie toksyczności prawdopodobnie będzie odzwierciedlać bezpośredni wpływ na nieprawidłowy fałdowanie (3-yynu. Następnie wykorzystaliśmy czyste białka do określenia, w jaki sposób Hsp104 moduluje agregację. Nasze badania podkreślają użyteczność terapeutyczną Hsp104 w chorobie neurodegeneracyjnej i dostarczają nowych informacji na temat kontrowersyjnych problemów związanych z tym, jak agregacja białek i tworzenie integracji przyczyniają się do patogenezy PD i innych chorób. Wyniki Hsp104 zmniejsza toksyczność indukowaną przez a-syninę. Nadekspresja zmutowanego ludzkiego yynu wektorami wirusowymi indukuje progresywną utratę neuronów dopaminergicznych nigral u gryzoni i naczelnych innych niż człowiek (42, 44. 46). Aby przetestować, czy Hsp104 moduluje agregację a-yny i indukowane przez a-syninę zwyrodnienie neuronów dopaminowych, jednocześnie ulegamy nadmiernej ekspresji Hsp104 i A30Py -syny w mózgu szczurów. Zawiesiny wirusów zawierające wektory lentiwirusowe kodujące ludzką a-Psy i Hsp104 (lenti-A30P / lenti-Hsp104, patrz Metody) lub ludzkie a-Psy i żółte fluorescencyjne białko A30P (lenti-A30P / lenti-YFP, patrz Metody) zostały bezpośrednio wstrzyknięte do istoty czarnej szczurów. Następnie plastry mózgu z istoty czarnej zostały wybarwione na marker hydroksylazy tyrozynowej (TH) dopaminergicznego enzymu ograniczającego szybkość w syntezie dopaminy. Zwierzęta, którym wstrzyknięto lentiwirusowe wektory kodujące A30Py -synę wykazywały 33% utratę neuronów TH-immunoreaktywnych (TH-IR) w istocie czarnej po 6 tygodniach po wstrzyknięciu (42). Co ważne, wirusowa ekspresja 2 białek reporterowych (YFP / GFP) nie powoduje żadnego uszkodzenia szlaku czarnoplazmatycznego (18). W przeciwieństwie do tego, wstrzyknięcie lenti-A30P / lenti-YFP z prawej strony szczurzej istoty czarnej indukowało znaczną utratę komórek TH-IR w porównaniu ze stroną bez iniekcji (Figura 1A), podobną do ekspresji samego A30Py-azyny . Koekspresja Hsp104 uratowała neurony TH-IR z toksyczności indukowanej A30Py-Ssy (Figura 1A). Ocena ilościowa utraty neuronów została przeprowadzona w całej istocie czarnej (ryc. 1B). Przeciwległa strona bez iniekcji została użyta jako kontrola wewnętrzna. Zwierzęta wykazujące ekspresję A30P / YFP wykazywały 31,4% utratę komórek TH-IR względem strony przeciwnej. Ekspresja Hsp104 spowodowała znaczące zmniejszenie utraty komórek (12,6%, P <0,05; n = 7). Analiza konfokalna zwierząt eksprymujących Hsp104 / A30P ujawniła, że przeżywające neurony dopaminowe wciąż wykazują znaczne ilości ludzkiego y -syny (Figura 1C). Figura 1Hsp104 zmniejsza utratę komórek dopaminergicznych w istocie czarnej szczurów eksprymujących ludzki P-Syn A30P. (A) Barwienie TH w 6 tygodniu w istocie czarnej szczurów, którym wstrzyknięto albo lenti-A30P / lenti-YFP albo lenti-A30P / lenti-Hsp104. (B) Ilościowe określenie neuronów nigralnych TH-IR w 6 tygodniu względem strony przeciwległej u szczurów jednostronnie wstrzykniętych różnymi konstruktami lentiwirusowymi. Wartości reprezentują średnią. SEM; n = 7 zwierząt dla grup A30P / YFP i A30P / Hsp104; P <0,05. (C) Obrazowanie konfokalne potrójnego znakowania dla TH (czerwony), ludzki a-Psy A30P (niebieski) i Hsp104 (zielony) w szczurzej istocie czarnej wstrzykniętej lenti-A30P / lenti-Hsp104. Wyższe powiększenie (dolny rząd) ujawnia liczne neurony TH, które są dodatnie dla ludzkiego. -Synu Hsp104 i A30P w 6 tygodniu po wstrzyknięciu. Pasek skali: 350 .m (A i C, górny rząd); 60 m (C, dolny rząd). Hsp104 zapobiega neurodegeneracji wywołanej A30Py-Scyna. Nigralowe neurony dopaminergiczne rzutują swoje zakończenia nerwowe bezpośrednio na prążkowie. Lentiwirusowa ekspresja A30P . -syny w istocie czarnej szczurów indukuje znaczną utratę terminali nerwu prążkowanego (42). Aby określić, czy ochronnemu działaniu Hsp104 na komórki dopaminergiczne towarzyszy zmniejszenie utraty zakończeń nerwowych w prążkowiu, barwienie TH przeprowadzono na prążkowiu w prążkowiu ze zwierząt wykazujących ekspresję A30P / YFP lub A30P / Hsp104 (Figura 2A). Figura 2Hsp104 zmniejsza indukowane przez a-synów dopaminergiczne zaniki włókien w prążkowiu u szczurów. (A) Sekcje prążkowia wybarwione na TH od szczurów po iniekcjach intranigralnych lenti-A30P / lenti-YFP lub lenti-A30P / lenti-Hsp104 (strzałki wskazują wstrzyknięte boki). Oryginalne powiększenie, × 3. (B) Ilościowa utrata włókien TH po 6 tygodniach, w stosunku do strony przeciwległej u szczurów jednostronnie wstrzykniętych różnymi wektorami lentiwirusowymi. Wartości reprezentują średnią. SEM; n = 7 zwierząt na grupę; P <0,05. Zwierzęta wykazujące ekspresję A30P / YFP wykazywały zmniejszenie markera TH po stronie ipsilateralnej (Figura 2A). Nigralowa ekspresja Hsp104 zmniejszyła utratę terminala nerwu dopaminergicznego indukowaną przez akumulację A30Py -syny (Figura 2A) [przypisy: zaburzenia psychiczne u dzieci, czopki eva qu, balsam szostakowskiego zastosowanie ] [patrz też: tonaxinum forte na noc, czopki eva qu, aerius dawkowanie ]