Mechanizm naprowadzania dla rekrutacji komórek progenitorowych szpiku kostnego do nowonaczyń ad 10

Każde doświadczenie przeprowadzono 3 razy z identycznymi wynikami, z 4 powtórzeniami na grupę leczoną. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą testu jednostronnego ucznia. Dodatkowo, 25000 komórek ludzkich znakowanych CMTMR na studzienkę wysiano na monowarstwy HUVEC w 96-dołkowych płytkach do hodowli przez 30 minut w 37 ° C w obecności 25 ug / ml (2,5 ug / 25 000 komórek) HP2 / 1, JBS5 LM609, P1F6, P4C10, blokujące funkcjonowanie przeciwciała anty-a2 (BD Biosciences. Pharmingen) i ludzkie rsVCAM (R & D Systems). Łącznie 25 000 komórek jednojądrzastych EGFP + szpiku kostnego, komórki Lin +, Lin. I LinSca1 + na studzienkę podobnie inkubowano na pojedynczych warstwach HUVEC w obecności 25 ug / ml (2,5 ug / 25 000 komórek) anty-A 4. (PS / 2, prezent od Biogen), anty-A ^ p (5H10-27, BD Biosciences. Pharmingen), anty-v (RMV-7, BD Biosciences. Pharmingen), lub anty-2 ( M18 / 2; BD Biosciences. Pharmingen). Wszystkie testy przeprowadzono w zbuforowanym HEPES HBSS zawierającym 3% BSA, mM CaCl2, mm MgCl2 i 0,1 mm MnCl2. Każde doświadczenie przeprowadzono 2-3 razy z identycznymi wynikami, z 4 powtórzeniami na grupę leczoną. Reprezentatywne pola sfotografowano przy x 200 i liczbę komórek przylegających do pola oceniano ilościowo w 5 polach na warunki leczenia. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą testu ucznia. Badania guza. Komórki PBMC wyznakowane CMTMR (2 x 106) lub komórki CD34 + (1 x 106) inkubowano w pożywce, 50 ug / ml nisko-endotoksynowej anty-avp3 (LM609) lub anty-ludzkiej a4. ( HP2 / 1, Biogen lub 9F10; BD) na lodzie przez 30 minut przed wstrzyknięciem myszom nagim noszącym raki piersi N202. W dodatkowych badaniach, podobnie inkubowano 0,5 x 106 komórek progenitorowych CD34 + przed wstrzyknięciem myszom nagim z guzami LLC o średnicy 0,5 cm (n = 6). Po godzinie zwierzęta uśmiercono. W niektórych badaniach komórki jajowe o wielkości 0,5 x 106 GFP + komórki jajnika chomika chińskiego, stabilnie transfekowane w celu ekspresji integryny a4 <1l, wstrzyknięto dożylnie nagim myszom z 0,5 cm guzami LLC (n = 3). Alternatywnie × 106 EGFP + Lin. lub komórki EGFP + Lin + wstrzyknięto nagim myszom mającym 0,5 cm guzy LLC. W jednym badaniu zwierzęta (n = 4) były leczone po wstrzyknięciu EGFP + Lin. komórki przez 12 godzin za pomocą 100 .l soli fizjologicznej, 200 .g niskiej endotoksyny IgG2b (BD Biosciences. Pharmingen), 200 .g niskiej endotoksyny anty-4 4 (1 (PS / 2, Biogen), niskiej endotoksyny przeciw VCAM (MK-1) lub 200 .g rsVCAM. W innych badaniach zwierzęta (n = 6) były leczone przez 5 dni 100 .l soli fizjologicznej, 200 .g niskiej endotoksyny anty-APM2 (BD Biosciences. Pharmingen) lub 200 .g niskiej endotoksyny przeciw-. 4 (1 (PS / 2; Biogen) co drugi dzień. Nagim myszom z 0,5 cm nowotworem HT29 do okrężnicy wstrzykiwano komórki CD34 + znakowane 1x106 CMTMR i traktowano przez 5 dni 100 .l solanki, 200 .g antyludzkiej a4 .1 (HP2 / 1) lub 200 5 przeciw ludzkiemu av (5 (P1F6) (n = 10). Przed uśmierceniem zwierzęta wstrzyknięto dożylnie lekiem FITC. Bandiera simplicifolia. Guzy i otaczającą tkankę łączną wycięto i zamrożono. Gęstość mikronaczyń oznaczano przez zliczanie naczyń CMTMR + CD31 + na 200 mikroskopowych pól w 10 losowo wybranych polach na guz w kriosekcjach o grubości 10 .m. Określono średnią gęstość naczyń we wszystkich guzach na grupę leczoną. Badania przeprowadzono dwukrotnie z identycznymi wynikami. Istotność statystyczną określono za pomocą testu ucznia. Przeszczep szpiku kostnego Szpik kostny od myszy FVB / NJ przeszczepiono do napromieniowanych myszy FVB / N, jak opisano wcześniej (1). Po 12 tygodniach myszom wstrzyknięto 400 | jl czynnika zmniejszonego przez czynnik wzrostu. Matrigel uzupełnionego o 400 ng / ml bFGF lub VEGF i leczono w dniach i 3 przez dożylne wstrzyknięcie soli fizjologicznej, 200. G / mysi szczur anty-mysi. 4 A (niska endotoksyna PS / 2) lub szczurzy anty-mysia integryna (2-niska endotoksyna Ml / 70; BD). Wtyczki wycięto po 5 dniach (n = 8). Krioprobówki inkubowano w X-gal lub barwiono immunologicznie za pomocą króliczej anty-galaktozydazy i szczurzego anty-mysiego CD31 (MEC13.3; BD). Eksperymenty przeprowadzono dwukrotnie z identycznymi wynikami. Pozytywne naczynia oceniano ilościowo w × 200 na 10 losowo wybranych pól mikroskopowych na czop. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą testu jednostronnego ucznia. Materiały uzupełniające Zobacz Dodatkowe dane Podziękowania Niniejsza praca została wsparta grantami dla J. Varnera z NIH, UCSD Cancer Center, Charlotte Geyer Foundation oraz American Heart Association. Chcielibyśmy podziękować Margaret Hogan za pomoc przy mikroskopii konfokalnej oraz Jeanine Kleeman, Yuhong Zhu i Robbie emu Chereshowi za doskonałą pomoc techniczną. Przypisy Stosowano nietypowe skróty: ACTB-EGFP, EGFP ulegające ekspresji pod kontrolą promotora p-aktyny z kurczaka; CMTMR, 5-i-6-4-chlorometylobenzoiloamino-tetrametylorododamina; CS-1, łączący segment-1; EGFP, ulepszone GFP; Lin, linia; LLC, rak płuca Lewisa; rsVCAM, rekombinowany rozpuszczalny VCAM. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów. [hasła pokrewne: choroba refluksowa dieta, problemy z tarczycą objawy, balsam szostakowskiego zastosowanie ] [hasła pokrewne: ultramedica kraków, pokrzywka icd 10, ortoprotex ]