Mechanizm naprowadzania dla rekrutacji komórek progenitorowych szpiku kostnego do nowonaczyń ad 9

Z tego, 3 x 106 komórek CD34 + o czystości 98% (określone przez analizę FACS dla ekspresji CD34) izolowano przez selekcję pozytywną przez 3 rundy selekcji immunologicznej dla ludzkiego CD34 (Miltenyi Biotech). Wszystkie badania na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committees UCSD, The Scripps Research Institute i Sidney Kimmel Cancer Center. Komórki jednojądrzaste z EGFP + szpiku kostnego (3 x 108) oczyszczono przez wirowanie w gradiencie z kości udowych i piszczeli 6 myszy ACTB-EGFP. Lin. komórki (4,8 x 106) izolowano z komórek jednojądrzastych pochodzących ze szpiku kostnego w 2 rundach selekcji negatywnej dla panelu markerów linii (CD5, B220, CDllb, Gr-1, 7-4 i Terll9; Miltenyi Biotech). Wybrana populacja była w 90% ujemna dla markerów linii i 80% pozytywna dla ekspresji c-kit. Komórki Lin + były w 100% pozytywne dla markerów linii. Komórki Lin. Sca 1+ (70% Sca1 +) (0,4 x 106) wyizolowano z Lin. komórki przez 3 rundy selekcji immunologicznej dla markera komórek macierzystych Sca1 + (Miltenyi Biotech). Mikroskopia wewnątrzgałkowa Komórki ludzkie znakowano CMTMR (Invitrogen Corp.) przez 15 minut na lodzie i przemywano. PBMC (2 x 106) lub komórkom CD34 + (1 x 106) wstrzyknięto iv w objętości 100 ul myszom z syngenicznym GFP + N202 lub guzami ujemnymi. Syngeniczne komórki nowotworu sutka N202 hodowano jako sferoidy nowotworowe i przeszczepiano na przeszczepioną sutkową poduszkę tłuszczową pod przezroczystą, grzbietowej fałdowej komory. Zwierzęta poddano sedacji, podczas gdy przeprowadzono mikroskopię fluorescencyjną in vivo. Eksperymenty przeprowadzono dwukrotnie z 2 myszami na grupę leczoną. W niektórych badaniach komórki wstrzykiwano razem z przeciwciałami antyintegrynowymi (końcowe stężenie wynoszące 50 .g / ml HP2 / anty-ludzki a4 (3l, P1F6 anty-av 5 lub LM609, anty-av 3). lub sól fizjologiczna). Mikroskopia fluorescencyjna została przeprowadzona przy użyciu mikroskopu Mikron Instrument (Mikron) wyposażonego w epi-iluminator i wyzwalane przez wideo stroboskopowe oświetlenie z łuku ksenonowego (MV-7600, EG i G). Aparat zintensyfikowany krzemem (SIT68; Dage-MTI) został przymocowany do mikroskopu. Procesor obrazu Hamamatsu (Argus 20) z wersją oprogramowania układowego 2.50 (Hamamatsu Photonic System) został użyty do poprawy obrazu i przechwycenia obrazów na komputerze. Zeiss Achroplan 20 × / 0,5 W, Zeiss długodystansowy 10 / 0.22, i Leitz PL1 / 0.04 cele zostały użyte do przechwytywania obrazów. Analiza FACS. Analiza FACS została przeprowadzona w UCSD Cancer Center Shared Resource. Mysie przeciwciała skoniugowane z PE, antyludzkie a-4 (1 (9F10) i PE-y5A (IIA1), pochodziły z BD. Sprzężone z PE anty-a2 (CLB-LFA 1/1) pochodziło z eBioscience, a skoniugowane z FITC przeciwciała anty-CD34 (AC136) i skoniugowane z PE anty-CD133 (AC133 / 1) pochodziły z Miltenyi Biotec. Mysi anty-ludzki avp3 (sprzężony z FITC LM609) i Av (5 (sprzężony z PE P1F6) pochodził z firmy Chemicon International. Szczur anty-mysi a-5 (1 (5H10-27), | v (RMV-7) i <2 (<18/2) skoniugowany w PE pochodził z BD. Sprzężone z PE anty-mysi a4 ^ (R1-2), c-kit (2B8) i Sca-1 (E13-161.7) pochodziły z eBioscience, a markery linii pochodziły z Miltenyi Biotec. Ekspresję VCAM na EC określono za pomocą P8B1 (Chemicon International). Ekspresję integryny a określono za pomocą mysiego anty-ludzkiego Ap P4C10 (dar Davida Cheresha, Centrum Chirurgii UCSD Moores), a ekspresję integryny a7 określono za pomocą szczurzego anty-ludzki FIB504 (FB B4) (BD Biosciences. Pharmingen). a następnie inkubację w skoniugowanych przeciwciałach drugorzędowych Alexa 488 (Invitrogen Corp.). Każdą analizę FACS przeprowadzono 2. 3 razy z identycznymi wynikami. Immunohistochemia. Pięć mikronowe kriosek- tyfikowano w acetonie i inkubowano w 5% BSA w PBS, następnie w pierwszorzędowym przeciwciele (5. 10. G / ml) przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Preparaty były dobrze przemywane, inkubowane w Alexa 488 (zielone), Alexa 568 (czerwone) lub Alexa 350 (niebieskie) sprzężone z drugorzędowym przeciwciałem przez godzinę w temperaturze pokojowej, przemyte i, w niektórych przypadkach, zabarwione DAPI. Pierwotne przeciwciała były następujące: anty-fibronektyna (TV-1, Chemicon International), szczurzy anty-mysia VCAM (M / K-2 z Chemicon International), przeciw pasztetowi VCAM (H-276, sc-8304 z Santa Cruz Biotechnology Inc.), szczurzy anty-mysi CD31 (MEC 13.3 z BD Biosciences. Pharmingen) i mysi anty-ludzki Ki67 (Chemicon International). Każdy eksperyment przeprowadzono 3 razy. We wszystkich badaniach immunohistochemicznych oznaczono ilościowo 8. 10 pól na próbkę tkanki i 3. 6 tkanek. Testy adhezji. Testy adhezji prowadzono przez 30 minut na 48-studzienkowych płytkach pokrytych 5 ug / ml rekombinowanej H120 CS-1 fibronektyny (z Martin J. Humphries, University of Birmingham, Birmingham, Wielka Brytania), fibronektyny osoczowej lub witronektyny jak opisano (39). Testy przeprowadzono w obecności pożywki adhezyjnej lub 25 .g / ml blokujących funkcje anty-A 4 (1 (HP2 / 1, prezent od Biogen), anty-A 5. (1 (JBS5, Chemicon International), przeciw av5 (P1F6; od Davida Cheresha) lub anti-vv3 (LM609; od David Cheresh) lub rsVCAM (R & D Systems) [podobne: sennik karmienie piersią, zaburzenia psychiczne u dzieci, rovamycyna ] [patrz też: transcendencja chomikuj, zgrubienie w pachwinie, rovamycyna ]