Przewlekłe limfocyty białaczkowe limfocyty B zawierają anormalną kinazę tyrozynową Lyn, przypuszczalnie przyczyniającą się do wadliwej apoptozy ad 5

Wartości IC50 dla PP2, SU6656, EGCG, CsA i Dex wynosiły odpowiednio 10 | j, 7,5 | jM, 10 | jM, 7 | jM i 10 | jM. Gdy komórki białaczkowe hodowano w obecności CsA lub Dex, zaobserwowano wyraźny wzrost apoptozy w porównaniu z komórkami hodowanymi w samej pożywce, co wykazano przez barwienie aneksyną V ( Figura 6) i analiza aktywacji kaspazy (Figura 7A). Co ciekawe, apoptoza komórek białaczkowych korelowała z dużym spadkiem zarówno aktywności podstawowej, jak i ilości Lyn (Figura 7B). Ekspozycja komórek białaczkowych na PP2 i SU6656 powodowała zarówno oczekiwane hamowanie nadeksprymowanej aktywności Lyn (Figura 7B), jak i wyraźną apoptozę komórek (Figury 6 i 7A). Aby potwierdzić swoisty udział Lyn w apoptozie komórkowej, przeprowadziliśmy eksperymenty kontrolne przy użyciu PP3, nieaktywnego analogu PP2. Jego dodanie w hodowlach komórkowych nie indukowało hamowania Lyn ani apoptozy komórek (dane nie pokazane). Składnik zielonej herbaty – 3-galusan epigallokatechiny (EGCG) działa jako środek zapobiegający rakowi ze względu na jego niezwykłą zdolność do indukowania apoptozy w komórkach rakowych poprzez aktywację kaspazy (36). Ponieważ niedawno wykazaliśmy, że EGCG hamuje Lyn zarówno in vitro, jak i w komórkach (37), analizowaliśmy wpływ tej katechiny na hodowle komórkowe B-CLL. Indukowana apoptoza komórek (Figury 6 i 7A) i hamowanie kinazy tyrozynowej (Figura 7B) spowodowane obecnością EGCG potwierdzają związek pomiędzy wysoką aktywnością Lyn i nieprawidłowym przeżyciem i akumulacją tych komórek białaczkowych. Figura 6 Wpływ różnych związków na apoptozę komórek BLL CLL. Komórki białaczkowe hodowano przez 24 godziny w monoterapii lub w obecności CsA (8 (3M), Dex (10 .M), PP2 (10 .M), SU6656 (10 .M) lub EGCG (10 .M), i apoptozę komórek analizowano za pomocą cytometrii przepływowej aneksyny V. PI. (A) Analiza metodą cytometrii przepływowej próbki B-CLL nr. 14. (B) Procent komórek apoptotycznych uzyskanych w różnych warunkach z następującymi próbkami B-CLL: nie. 2 (wypełnione odwrócone trójkąty), nie. 4 (otwarte odwrócone trójkąty), nie. 6 (wypełnione trójkąty), nie. 9 (otwarte kółka), nie. 14 (wypełnione kwadraty), nie. 17 (wypełnione koła), nie. 28 (wypełnione diamenty), nie. 33 (strzałki), nie. 35 (otwarte trójkąty) i nie. 39 (otwarte kwadraty). (C) Dane są podawane jako mediana, dolny i górny kwartyl, a także minimalny i maksymalny. * P <0,005 w porównaniu z komórkami hodowanymi w samej pożywce (Ctrl). Min-max, minimum. Maksimum. Figura 7 Wpływ różnych związków na aktywność kaspazy i Lyn komórek CLL B. Limfocyty białaczkowe hodowano bez lub z lekami, jak opisano na Fig. 6. (A) Aktywność kaspazy analizowano metodą Western blotting z przeciwciałem przeciwko białku PARP, substratowi kaspazy. Strzałki wskazują pozycję białka pełnej długości (116 kDa) i jego fragmentu pociętego (89 kDa). (B) Komórki białaczkowe poddano lizie i Lyn poddano immunoprecypitacji. Immunokompleksy następnie analizowano pod kątem zarówno aktywności kinazy in vitro, jak i immunobarwienia anty-Lyn. Dane, w stosunku do próbki nr. 14, są reprezentatywne dla eksperymentów przeprowadzonych z tymi samymi próbkami B-CLL analizowanymi na Figurze 6B. Dyskusja Badanie to zostało zaprojektowane w celu zbadania determinant molekularnych, które są odpowiedzialne za przedłużone przeżycie i gromadzenie się komórek białaczkowych u pacjentów z B-CLL. Aby odpowiedzieć na to pytanie, przeanalizowaliśmy kinazę Src Lyn, białko, które odgrywa kluczową rolę w transdukcji sygnałów przeżycia lub apoptozy po uruchomieniu BCR. Analiza złośliwych limfocytów B uzyskanych z krwi obwodowej 40 pacjentów z CLL wykazała, że kinaza tyrozynowa Lyn wykazuje anomalne właściwości, które przyczyniają się do patologii tych komórek białaczkowych. W szczególności odkryliśmy, że ekspresja Lyn wykryta w świeżo izolowanych komórkach białaczkowych uzyskanych od wszystkich pacjentów z CLL była 2,5 do 5 razy większa niż w prawidłowych limfocytach B, co sugeruje, że nadmierna ekspresja tego białka stanowi szczególną właściwość tych złośliwych komórek. Dowody, że poziom mRNA Lyn był porównywalny w prawidłowych i nowotworowych komórkach B, pokazują, że anomalna ekspresja białka nie była związana z różnicami w transkrypcji genów i / lub stabilności mRNA. Możliwe hipotezy wyjaśniające różne ekspresje białka Lyn między białaczką a prawidłowymi komórkami B mogą być reprezentowane przez deregulację w obrocie białka. W tym kontekście wadliwa apoptoza limfocytów B-CLL powiązana jest z deregulacją szlaku systemu ubikwityna-proteasom (38), który jak twierdzono, odpowiada za degradację Lyn (39). Za pomocą mikroskopii konfokalnej i różnicowych analiz ultrawirowania zaobserwowaliśmy, że białko Lyn było nieprawidłowo rozmieszczone w komórkach nowotworowych w porównaniu z normalnymi komórkami B, pod dwoma głównymi względami. [podobne: balsam szostakowskiego zastosowanie, operacja ścięgna achillesa, zaburzenia psychiczne u dzieci ] [patrz też: przychodnia władysławowo, szczepionka na dur brzuszny, brak szczęścia w miłości ]