Przewlekłe limfocyty białaczkowe limfocyty B zawierają anormalną kinazę tyrozynową Lyn, przypuszczalnie przyczyniającą się do wadliwej apoptozy ad 7

To odkrycie jest potwierdzone przez traktowanie komórek BLL CLL Dex, CsA i EGCG, które silnie obniżają podstawową aktywność Lyn i zwiększoną apoptozę komórek białaczkowych, co sugeruje, że apoptotyczny efekt tych leków jest mediowany przez obniżenie poziomu Lyn. Nasza hipoteza jest również zgodna z innymi doniesieniami wykazującymi, że aktywacja Lyn w liniach komórek krwiotwórczych (45. 47) lub aktywna nadmierna ekspresja Lyn w komórkach nabłonkowych odgrywa kluczową rolę w zapobieganiu apoptozie komórek (48). Odpowiednio, 3-krotny wzrost apoptotycznych komórek pre-B obserwowano u myszy z niedoborem ekspresji kinaz Src Lyn, Fyn i Blk w porównaniu z myszami typu dzikiego (49). Dane te mogą mieć znaczenie kliniczne, ponieważ identyfikują kinazę Src Lyn jako potencjalny cel dla leków zdolnych do indukowania apoptozy w komórkach białaczkowych B-CLL. Metody Pacjenci, separacja komórek i warunki hodowli. Po uzyskaniu świadomej zgody uzyskaliśmy krew obwodową od 40 nieleczonych pacjentów z rozpoznaniem B-CLL potwierdzoną klinicznymi, patologicznymi i cytometrycznymi kryteriami przepływu (1). Charakterystykę pacjentów podano w Tabeli 1. PBMC pacjentów izolowano przez wirowanie w gradiencie gęstości w stosunku do Ficoll-Hypaque, jak wcześniej podano (50). Komórki B oczyszczono z komórek PBMC, usuwając limfocyty T metodą rozetową z erytrocytami owiec i monocytami przez przyleganie do powierzchni plastyku, jak wcześniej podano (51). Jak oceniono za pomocą cytometrii przepływowej, zawartość komórek B CD19 + była większa niż 95% we wszystkich próbkach. Nietuszone limfocyty B krwi obwodowej izolowano z PBMC 5 prawidłowych dawców przez selekcję negatywną, stosując zestaw do izolacji komórek B i kolumny do rozdzielania MACS (Milteny Biotec). Oczyszczone migdałkowe komórki B otrzymano z 3 migdałów, jak opisano wcześniej (52). Czystość uzyskanych komórek krwi obwodowej i migdałków B wynosiła co najmniej 95% (CD19 +), co oceniono za pomocą cytometrii przepływowej. Dla wybranych eksperymentów limfocyty B z krwi obwodowej wzbogacono dla naiwnych i pamięci komórek B zgodnie z ich reaktywnością względem CD27. Pokrótce, oczyszczone limfocyty B z krwi obwodowej inkubowano z CD27 MicroBeads (Milteny Biotec) i frakcjonowano do CD19 + / CD27 + (komórki pamięci B) i CD19 + / CD27. (naiwne komórki B) o czystości powyżej 98%. Oczyszczone komórki B (2 x 106 komórek / ml) hodowano w pożywce RPMI-1640 (Sigma-Aldrich) uzupełnionej 10% ogrzewaną inaktywowaną płodową surowicą cielęcą (ICN Flow), 2 mM L-glutaminą, 100 U / ml penicyliny, i 100 | jg / ml streptomycyny w 24-studzienkowych płytkach (Costar), w 37 ° C w nawilżonej atmosferze zawierającej 5% CO2. W innym eksperymencie komórki inkubowano kilka razy bez lub z kozim anty-ludzkim IgM F (ab.) 2 (10. G / ml) (Caltag Laboratories). Analiza komórkowej fosforylacji tyrozyny i aktywności kinazy tyrozynowej. Komórki (5 x 105 dla każdego testu) preinkubowano przez 15 minut pod nieobecność lub obecność PP2 (7,5 .M), SU6656 (7,5 .M), piceatannolu (15 .M), LFM-A13 (20 .M), AG490 (20. M), AG1296 (20. M), AG1478 (20. M) lub genisteina (20. M) (Calbiochem). Komórki ponownie zawieszono i szybko lizowano w buforze A (bufor 62 mM Tris / HCl, pH 6,8, zawierający 5% glicerolu, 0,5% SDS i 0,5%. -Merkaptoetanolu). Próbki następnie poddano SDS / PAGE (10% żeli), przeniesiono na błonę nitrocelulozową i wybarwiono immunologicznie monoklonalnym przeciwciałem przeciw fosfotyrozynie (PY-20) (ICN Biotechnology) stosując wzmocniony chemiluminescencyjny system detekcji (ECL, Amersham Pharmacia Biotech). W celu analizy aktywności komórkowej kinazy tyrozynowej, komórki (4 x 105 dla każdego testu), wstępnie inkubowane z lub bez inhibitorów kinazy tyrozynowej, jak opisano powyżej, poddano lizie przez dodanie 0,5% koktajli Triton X-100 i fosfatazy i inhibitora proteazy w 25-. L Tom przez 15 minut. Aktywność kinazy tyrozynowej testowano następnie w 50 ul pożywki fosforylacyjnej zawierającej 50 mM Tris / HCl, pH 7,5, 10 mM MnCl2, 30 | jM [a 32P] ATP (Amersham Pharmacia Biotech) (aktywność właściwa 1000 cpm / pmol), 200. M ortowanadanu sodu i albo mg / ml losowego polimeru poliGlu4Tyr (Sigma-Aldrich) albo 200. M cdc2 (6. 20) peptydu (29) (uprzejmie dostarczony przez O. Marin, Uniwersytet Padwy, Padwa, Włochy) stosowane jako substraty egzogenne. Po 10 minutach inkubacji w 30 ° C reakcje zatrzymano i próbki naniesiono na SDS / PAGE. Substrat fosforylację 32P oznaczono ilościowo w Packard InstantImager. Analiza ekspresji kinazy komórkowej Src. Komórki poddano lizie i wybarwiono immunologicznie przeciwciałami anty-Lyn, anty-Src, anty-Fyn, anty-c-Fgr i anty-Lck (Santa Cruz Biotechnology), jak opisano powyżej. Następnie bloty poddano odpędzaniu i powtórnie potraktowano przeciwciałem (3-aktynowym (Santa Cruz Biotechnology)
[patrz też: samotne dziewczyny szukajace chłopaków, femoston mini, licówki porcelanowe cennik ]
[hasła pokrewne: femoston mini, kamila biedrzycka osica wikipedia, tonaxinum forte na noc ]