Przewlekłe limfocyty białaczkowe limfocyty B zawierają anormalną kinazę tyrozynową Lyn, przypuszczalnie przyczyniającą się do wadliwej apoptozy ad 8

Ekspresję białkową kinaz Src oznaczono ilościowo za pomocą analizy densytometrycznej z użyciem przyrządów ImagerMaster VDS (Amersham Pharmacia Biotech). IP i aktywność kinazy in vitro różnych kinaz Src. W celu przeanalizowania całkowitej aktywności komórkowej różnych kinaz Src, komórki (2 x 106 dla każdego oznaczenia) ponownie zawieszono i poddano lizie przez godzinę w 4 ° C w 450 ul buforu B zawierającego 20 mM Tris / HCl, pH 7,5, 10% glicerol, 1% Triton X-100, mM EDTA, 50 mM NaCl, mM ortowanadan sodu i koktajl inhibitora proteazy. Po odwirowaniu supernatanty inkubowano przez 2 godziny w temperaturze 4 ° C z odpowiednim przeciwciałem kinazy Src związanym z białkiem Aa-sefarozą. Immunokompleksy przemyto 3 razy przez odwirowanie i ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w buforze C (50 mM Tris / HCl, pH 7,5, zawierający koktajle fosfataz i inhibitorów proteazy). Granulki solubilizowano w 30 ul buforu C pod kątem aktywności kinazy i, jako kontrolę, dodano 5 ul dodatkiem 20 ul buforu A pozbawionego p-merkaptoetanolu, nałożono na SDS / PAGE i wybarwiono immunologicznie odpowiednim Src. przeciwciało kinazy. Aby przetestować aktywność kinazy IP, 20 .l immunokompleksów inkubowano w 30 .l pożywki fosforylacji opisanej powyżej, stosując jako substrat peptyd 200 .M cdc2 (6 O20). Po 10 minutach inkubacji w 30 ° C, próbki naniesiono na SDS / PAGE i analizowano pod względem fosforylacji peptydów 32P (patrz powyżej) i barwienia immunologicznego za pomocą odpowiedniego przeciwciała kinazy Src. Lokalizacja subkomórkowa Lyn. Około 4 x 106 komórek poddano działaniu ultradźwięków w 400 .l izotonicznego buforu zawierającego 50 mM Tris / HCl (pH 7,5), 0,25 M sacharozy, mM ortowanadanu i koktajlu inhibitora proteazy (Boehringer) i wirowano przy 10 000 g przez 10 minut w celu w celu oddzielenia frakcji cząstek stałych zawierającej szczątki komórek, jądra komórkowe i inne cząstki komórkowe (peletka I). Supernatant dalej odwirowano przy 100 000 g przez godzinę w celu oddzielenia cytosolu od mikrosomów (peletka II). Osady ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 400 ul buforu B i 20 ul różnych frakcji załadowano na SDS / PAGE, poddano blottingowi i wybarwiono immunologicznie za pomocą przeciwciała anty-Lyn lub przeciwciał specyficznych dla następujących markerów kontrolnych dystrybucji: Complex II (Molecular Probes), SERCA2 (Sarco (endo) plazmowy Reticulum Ca2 + -ATPaza) (Afforeore Bioreagents) i CD79b (Santa Cruz Biotechnology). Resztkową ilość różnych frakcji użyto do przeprowadzenia immunoprecypitacji Lyn i testu kinazy in vitro, jak opisano w poprzednim akapicie. Analiza cytometrii przepływowej. Następujące monoklonalne przeciwciała zastosowano do barwienia metodą immunofluorescencji bezpośredniej: CD3aFITC, CD19aFITC (BD), anty-IgMcFITC, anty-IgDcFITC (DAKO), CD5yE PE, CD16aEF, CD23yEEP, CD38. PE i CD79b . PE (BD Biosciences. Pharmingen). Komórki oceniano za pomocą analizatora FACScalibur (systemy immunocytometryczne BD Biosciences .) i dane przetwarzano za pomocą oprogramowania CellQuest (BD). Testy apoptozy. Komórki B, inkubowane z CsA (8. M) lub bez niego, Dex (10. M) (Sigma-Aldrich), PP2 (10. M), SU6656 (10. M) lub EGCG (10. M) (Calbiochem) przez 24 godziny zebrano przez odwirowanie i przemyto raz PBS. Ekspozycję reszt fosfatydyloseryny oceniono ilościowo przez wybarwienie powierzchniowe aneksyny V stosując protokół przedstawiony w zestawie Bender (Bender Medsystems). Łącznie x 106 komórek ponownie zawieszono w 200 ul buforu wiążącego (10 mM HEPES, pH 7,4, 140 mM NaCl i 5 mM CaCl2), a następnie inkubowano z 0,5 ug / ml aneksyny V. FITC przez 15 minut. w ciemności. Komórki ponownie przemyto i ponownie zawieszono w buforze wiążącym. Następnie do każdej próbki dodano 5 .l (20 .g / ml) jodku propidyny (PI) przed analizą metodą cytometrii przepływowej (analizator FACScalibur, systemy immunocytometryczne BD Biosciences .). Dziesięć tysięcy komórek na próbkę uzyskano przy użyciu oprogramowania CellQuest (BD), a dane analizowano przez wykreślenie na logarytmicznym scattergramie aneksyny V. PI. Rozszczepienie szerokiego substratu kaspazowego PARP określono przez analizę Western blot. Łącznie 0,5 x 106 komórek ponownie zawieszono i szybko lizowano w buforze A (62 mM Tris / HCl, pH 6,8, 5% glicerolu, 0,5% SDS i 0,5% P-merkaptoetanolu). Próbki następnie poddano SDS / PAGE (10% żeli), przeniesiono na błonę nitrocelulozową i wybarwiono immunologicznie za pomocą przeciwciała poliklonalnego PARP (Cell Signaling). Analiza w mikroskopie konfokalnym. Przeprowadzono agregację lub łatanie błon lipidowych. Limfocyty B inkubowano z nieznakowaną toksyną cholery. podjednostka (Sigma-Aldrich), która wiąże się z gangliozydem GM1, komponentem mikrodomenek błony lipidowej (53). Po 30 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej komórki przemyto dwukrotnie PBS, a następnie inkubowano z króliczą toksyną B przeciwko cholery przez 30 minut.
[więcej w: operacja ścięgna achillesa, szczepionka na dur brzuszny, kawa rozpuszczalna skład ]
[hasła pokrewne: czopki eva qu, aerius dawkowanie, chrypka icd 10 ]