Przewlekłe limfocyty białaczkowe limfocyty B zawierają anormalną kinazę tyrozynową Lyn, przypuszczalnie przyczyniającą się do wadliwej apoptozy ad 9

W celu łatania, przeprowadzono trzecią inkubację z anty-króliczym Texas Red. Skoniugowanym przez 30 minut na lodzie. Następnie limfocyty B, w stężeniu 0,4 x 106 / ml, umieszczono w objętości 50 ul / studzienkę na szkiełkach powlekanych poli-L-lizyną (Poliscience Inc.). Równą objętość 4% paraformaldehydu dodano w ciągu 10 minut w temperaturze pokojowej w celu utrwalenia komórek. Ustalone komórki następnie przemyto dwukrotnie PBS i permeabilizowano 0,1% Triton X-100 przez 4 minuty. Przed barwieniem niespecyficzne wiązanie z białkiem blokowano przez inkubację szkiełek przez 30 minut w 1% BSA. Komórki następnie wybarwiono rozcieńczonym 1/50 mysim monoklonalnym IgG2a anty-Lyn (Santa Cruz Biotechnology) przez 15 minut w ciemności, przemyto i barwiono dodatkowym Ig Ig skoniugowanym z FITC (Dako). Swoistość barwienia kontrolowano stosując przeciwciała kontrolujące izotyp, a następnie odpowiednie fluorescencyjne przeciwciała drugorzędowe. Barwienie tła z przeciwciałami kontrolnymi rutynowo porównywano z komórkami wybarwionymi dodatnio i nie było widoczne przy identycznych ustawieniach akwizycji. Skrawki zamontowano przy użyciu szkiełek nakrywkowych i wykrywano fluorescencję przy użyciu konfokalnego mikroskopu Biorad wyposażonego w zestaw filtrów fluorescencyjnych do wzbudzania przy 488 nm. Analiza transkryptów Lyn w RT-PCR. Całkowity RNA ekstrahowano z 4 x 10 x 106 oczyszczonych komórek B przy użyciu zestawu RNeasy Mini Kit (Qiagen), zgodnie z instrukcjami producenta. C-RNA pierwszej nici syntetyzowano z .g całkowitego RNA w całkowitej objętości 20 .l przy użyciu starterów oligo (dT) i systemu odwrotnej transkrypcji Promega (Promega Corp.), zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku ludzkiej Lyn, 2 .l cDNA amplifikowano w całkowitej objętości 50 .l w obecności 20 .M następujących primerów: 5 -GGAGGAGCCCATTTACATCATCA-3. i 5 (3-AGTTCTCCACACGGGGCATCC-3 .. Powiększyło to grupę o 470 bp. Mieszanina reakcyjna składała się z 1,5 mM MgCl2, 500 mM KCl, 200. M dNTP i 2,5 U Taq polimerazy (Applied Biosystems). Warunki reakcji wynosiły minutę denaturacji w 94 ° C, minutę hybrydyzacji w 66 ° C i 3 minuty wydłużania w 72 ° C przez 25 cykli, a następnie końcowe wydłużenie 7 minut w 72 ° C. Dla (3-aktyny, 2 .l cDNA zamplifikowano w całkowitej objętości 50 .l w obecności 20 .M następujących starterów: 5 -GTGGGGCCCCCCCGGCACCA i 5 -GAAATCGTGCGTGACATTAAGGAG-3 3. Powiększyło to produkt o 540 parach zasad. Mieszanina reakcyjna była podobna do tej stosowanej dla ludzkiej Lyn. Warunki reakcji wynosiły 30 sekund denaturacji w 94 ° C, 30 sekund wyżarzania w 57 ° C i 40 sekund wydłużenia 72 ° C przez 25 cykli, a następnie końcowe przedłużenie o 7 minut w 72 ° C. Podwielokrotności produktów PCR rozdzielano przez elektroforezę na 2% żelu agarozowym i wizualizowano przez barwienie bromkiem etydyny. Analiza Northern blot transkrypcji Lyn. Całkowity RNA z komórek B (15 | ig) rozdzielono na 1% żelu formaldehydowo-agarozowym, wybarwiono bromkiem etydyny i przeniesiono na membranę nylonową (Hybond-N +, Amersham Pharmacia Biotech), stosując standardowe protokoły. Membranę hybrydyzowano z sondą lynową wyznakowaną 32P, pochodzącą z produktu amplifikacji RT-PCR, odpowiadającą nukleotydom 1110. 1,859 zgodnie ze standardowym protokołem hybrydyzacji. W celu zapewnienia jakości i ilości analizowanego RNA, blot przemywano i ponownie badano pod kątem ekspresji p-aktyny. Gęstość pasm analizowano na Packard InstantImager. Analiza sekwencjonowania cDNA Lyn. Całkowity RNA otrzymano z oczyszczonych komórek B u 4 pacjentów z B-CLL z zestawem RNeasy Mini (Qiagen). Jeden mikrogram całkowitego RNA poddano odwrotnej transkrypcji do cDNA przy użyciu systemu odwrotnej transkrypcji Promega (Promega Corp.). Następnie, w celu powielenia całego regionu kodującego genu Lyn, cDNA zamplifikowano za pomocą PCR, stosując następujące pary starterów: 5 (3 -GAACTCAAGTCACCGTGGAGC-3. i 5a -TCCGGGTGGATGCCATCATAG-3 .; 5. -AGATCCAGAGGAACAAGGAGAC-3. i 5a-CTAATAAGGAAAGCTCCAGCGC-3 .; 5. -CGCAGAAAGGCAGCTTTTGGC-3. i 5-GAGCCTCACGAGCTTGTCATG-3 .; i 5. -AGGTGGCTGTGAAAACCCTG-3. i 5a-AAATGGACGGGTCTCCCTGT-3 .. Każdy ze zamplifikowanych fragmentów oczyszczono z 2% żelu agarozowego za pomocą zestawu QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) i bezpośrednie sekwencjonowanie przeprowadzono przy użyciu zestawu ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) i sekwenatora DNA ABI PRISM 310 (Applied Biosystems) z tymi samymi starterami jak w PCR. Wszystkie reakcje sekwencjonowania przeprowadzono zarówno w kierunku do przodu jak i do tyłu. Sekwencje porównano z opublikowaną ludzką sekwencją mRNA Lyn (numer dostępu GenBank M16038). Analiza statystyczna. Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu testu dopasowanych par Wilcoxona. Dane są podawane jako mediana, dolny i górny kwartyl, a także minimalny i maksymalny Wartości P mniejsze niż 0,05 uznano za statystycznie istotne. Podziękowania Autorzy pragną podziękować Martinowi Donachowi za pomoc w przygotowaniu manuskryptu. Praca ta została poparta przez Włoskie Stowarzyszenie Badań nad Rakiem, Mediolan, Włochy; Ministero dell. Istruzione, dell. Universit. e della Ricerca (FIRB-2001 and PRIN-2002), Rzym, Włochy; i Ministero della Salute, Rzym, Włochy. Footnotes Antonella Contri i Anna Maria Brunati w równym stopniu przyczyniły się do tej pracy. Zastosowano niestandardowe skróty: B-CLL, przewlekła białaczka limfocytowa z komórek B; BCR, receptor komórek B; CLL, przewlekła białaczka limfocytowa; CsA, cyklosporyna A; Dex, deksametazon; EGCG, 3-galusan epigallokatechiny; ITAM, motyw aktywacyjny oparty na immunoreceptorowej tyrozynie; PI, jodek propidyny. Konflikt interesów: Autorzy zadeklarowali brak konfliktu interesów.
[hasła pokrewne: piramida żywieniowa dla dzieci, operacja ścięgna achillesa, prostowanie keratynowe cennik ]
[przypisy: hydrominum skutki uboczne, samotne dziewczyny szukajace chłopaków, odkwaszanie organizmu cytryna ]