Przewlekłe limfocyty białaczkowe limfocyty B zawierają anormalną kinazę tyrozynową Lyn, przypuszczalnie przyczyniającą się do wadliwej apoptozy ad

Podczas gdy ilość i aktywność Lyn są zmniejszane przez leki, które indukują apoptozę w hodowanych komórkach BLL, inhibitory Lyn znacznie zmniejszają przeżycie komórek białaczkowych. Wyniki Fosforylacja białka tyrozyny jest nieprawidłowa w B-CLL. Komórkowa białkowa fosforylacja tyrozyny komórek B jest przedstawiona na Fig. 1. Normalne limfocyty B, stosowane jako kontrole, wykazały bardzo niską fosforylację tyrozyny, podczas gdy świeżo wyizolowane komórki białaczkowe z 40 analizowanych pacjentów wykazywały nienormalnie wysokie barwienie immunologiczne dla fosforylowanej tyrozyny. Próbki CLL przedstawione na Figurze wybrano w celu włączenia pacjentów zdefiniowanych w różnych stadiach klinicznych (Tabela 1) i reprezentatywnych dla różnych otrzymanych wzorów fosforylacji białek tyrozynowych. W szczególności, blot Western pokazany dla próbek 6, 24 i 39 był najbardziej reprezentatywny w naszej serii pacjentów. Figura Analiza fosforylacji białkowej tyrozyny w komórkach B prawidłowych i CLL. Analiza immunoblot komórkowych białek ufosforylowanych w prawidłowych komórkach B, zarówno z migdałka (T) i krwi obwodowej (P), jak i białaczkowych komórek B-CLL. Komórki poddano lizie, a białka analizowano metodą blottingu Western (Wb) i barwie immunologicznej za pomocą przeciwciała przeciw fosforylowanej tyrozynie. Filtr poddano repobulacji przeciwciałem anty-aktynowym jako kontrola obciążenia. Masa cząsteczkowa standardów białkowych wskazana jest po prawej stronie. Dane są reprezentatywne dla eksperymentów przeprowadzonych z 3 różnymi migdałkami, 5 próbkami krwi obwodowej i 40 próbkami B-CLL. Tabela Charakterystyka biologiczna i kliniczna pacjentów Aby uzyskać informacje o kinazie tyrozyny odpowiedzialnej za fosforylację tyrozyny o wysokim podstawowym B-CLL, hodowaliśmy komórki białaczkowe otrzymane od pacjentów z CLL w obecności następujących inhibitorów selektywnych dla różnych kinaz tyrozynowych. : PP2 i SU6656 (rodzina Src) (21); piceatannol (Syk) (22); LFM-A13 (Btk) (23); tyrfostyna AG490 (JAK2, JAK3) (24); tyrfostyna AG1296 (kinazy pochodne płytkowe a – i kinazy receptora a, c-kit) (25); i tyrfostyna AG1478 (kinaza receptora naskórkowego czynnika wzrostu) (26). Figura 2A pokazuje reprezentatywne doświadczenia uzyskane z 2 próbek CLL. Dopiero dodanie PP2 i SU6656 prawie zniosło komórkowe barwienie immunologiczne na fosforylowaną tyrozynę, co pokazuje, że nieprawidłowa fosforylacja tyrozyny B-CLL była katalizowana przez kinazę (y) tyrozyny wrażliwą na te inhibitory. PP2 i SU6656 są najsilniejszymi i najbardziej selektywnymi inhibitorami dla kinaz tyrozynowych z rodziny Src. Ponieważ ich struktury nie są ze sobą powiązane, niewiele niespecyficznych efektów PP2 różniło się od tych w SU6656. W związku z tym sugerowano łączne stosowanie tych dwóch inhibitorów do identyfikacji specyficznych fizjologicznych ról kinaz Src (21). Genisteina, nieselektywny inhibitor indukowanej przez BCR fosforylacji tyrozyny (27), częściowo zmniejszył komórkową fosforylację tyrozyny tylko przy wysokich stężeniach, co również wpłynęło na kinazę Src (28) (Figura 2A). Figura 2 Wpływ kilku inhibitorów na komórkową fosforylację tyrozyny CLL i aktywności kinazy tyrozynowej. Świeżo izolowane limfocyty B otrzymane od pacjentów z CLL nr. 19 i nie. 40 hodowano przez 15 minut bez lub ze wskazanymi inhibitorami kinazy tyrozynowej. (A) Komórki poddawano lizie i analizowano przez wybarwianie immunologiczne za pomocą przeciwciała przeciw fosforylowanej tyrozynie, jak na Figurze 1. Masa cząsteczkowa (kDa) standardów białka jest wskazana w centrum. (B i C) Komórki poddano lizie i aktywność kinazy tyrozynowej wykryto albo na substracie peptydowym swoistym dla Src cdc2 (6 a 20) (B), albo na nieswoistym losowym polimerze poliGlu4Tyr (C). Dane są reprezentatywne dla eksperymentów przeprowadzonych z 8 różnymi próbkami B-CLL. Ctrl, kontrola. W celu potwierdzenia swoistości zaangażowania kinazy Src w podstawową fosforylację tyrozyny B-CLL, komórki białaczkowe hodowane bez inhibitorów kinazy tyrozynowej i z tymi inhibitorami kinazy tyrozynowej poddano lizie i aktywność kinazy tyrozynowej lizatów komórkowych badano in vitro na Src-specyficznym lub specyficznym dla Src. niespecyficzny substrat. Selektywne hamowanie przez PP2 i SU6656 aktywności kinazy testowanej na peptydzie swoistym dla Src cdc2 (6. 20) (29) wykazało, że konstytutywna aktywność Src była rzeczywiście obecna w lizatach B-CLL i była downmodowana przez wysoce selektywne inhibitory w tych peptydach. warunki (Figura 2B). Równolegle, stwierdzenie, że spośród zastosowanych inhibitorów tylko PP2 i SU6656 znosiło testowaną aktywność kinazy na niespecyficznym substracie poliGlu4Tyr (Figura 2C) potwierdziło, że całkowita aktywność kinazy tyrozynowej została katalizowana przez enzym (y) należący do rodziny Src . Poziom białka Lyn ulega nadekspresji w komórkach B CLL
[hasła pokrewne: brzoskwinie wartości odżywcze, sennik karmienie piersią, urofuraginum dla dzieci ]
[podobne: medicor rzeszow, xarelto apteka internetowa, urofuraginum dla dzieci ]