Przewlekłe limfocyty białaczkowe limfocyty B zawierają anormalną kinazę tyrozynową Lyn, przypuszczalnie przyczyniającą się do wadliwej apoptozy cd

Ponieważ Lyn jest członkiem rodziny Src, która jest głównie eksprymowana w limfocytach B i jest jedną z pierwszych cząsteczek uczestniczących w transdukcji sygnałów z BCR, ocenialiśmy ilość białka Lyn obecnego w białaczce Komórki B odzyskane od pacjentów z CLL w odniesieniu do normalnych limfocytów B. W porównaniu z limfocytami B kontrolnymi, wszystkie 40 analizowanych próbek B-CLL eksprymowało większe ilości izoform zarówno p53, jak i p56 (Figura 3A). Analiza densytometryczna zawartości białka Lyn wykazała nadekspresję B-CLL w zakresie od 2,5 do 5 razy większą niż ilość obserwowana w prawidłowych komórkach B. W przeciwieństwie do tego, analiza Western blot Src, Fyn, c-Fgr i Lck wykazała, że ilości białek komórkowych tych kinaz Src były podobne w komórkach prawidłowych i białaczkowych (Figura 3A). Figura 3 Ekspresja białek kinazy Src i mRNA Lyn w prawidłowych i CLL komórkach B. (A) Analiza immunoblotów poziomu białka komórkowego różnych kinaz Src. Lizaty uzyskane z prawidłowych limfocytów B i białaczkowych limfocytów B od pacjentów z CLL analizowano przez immunobarwienie przeciwciałami przeciw wskazanym kinazom Src. Bloty były reprobowane przeciwciałem anty-aktynowym jako kontrola obciążenia (pokazane jest powtórzenie testu Lyn). Panel jest reprezentatywny dla analizy Lyn wykonanej z 3 różnymi migdałkami, 5 próbek krwi obwodowej i 40 próbek B-CLL. Analizę innych kinaz Src przeprowadzono przy użyciu 10 próbek CLL. (B) Analizę immunolokalizacji Lyn przeprowadzono za pomocą mikroskopii konfokalnej w 3 różnych próbkach prawidłowych i 10 B-CLL. Oryginalne powiększenie, × 60. (C) Analizę ekspresji mRNA Lyn i p-aktyny przeprowadzono metodą Northern blotting w 16 próbkach B-CLL i tych samych prawidłowych komórkach B, które przedstawiono w A. Dane dla 8 reprezentatywnych pacjentów B-CLL. Rozkład Lyn analizowany w prawidłowych komórkach B za pomocą mikroskopii konfokalnej (figura 3B) pojawiał się punktowo i losowo w poprzek błony komórkowej. Przeciwnie, bardziej intensywna i koalescencyjna fluorescencja ujawniła, że nienormalna ilość Lyn była obecna w błonie komórkowej komórek białaczkowych (Figura 3B). Aby określić, czy nienormalnie wysoka ekspresja białka Lyn w białaczkowych limfocytach B wynikała z rozregulowanej transkrypcji, zbadaliśmy ekspresję mRNA kodującego kinazę tyrozynową. Podobne ilości stwierdzono w białaczce i prawidłowych limfocytach B, co oceniono na podstawie analizy Northern blot próbek 16 B-CLL (Figura 3C) i analizy RT-PCR próbek 40 B-CLL (danych nie przedstawiono). Lyn jest konstytutywnie aktywny i słabo reaguje na zaangażowanie BCR w B-CLL. Ponieważ Lyn ma obniżoną ekspresję w niestymulowanych prawidłowych komórkach B i staje się aktywna po zaangażowaniu BCR (30. 32), następnie badaliśmy aktywność enzymu w świeżo izolowanych limfocytach B zaangażowanych w BCR. Aktywność Lyn była prawie niewykrywalna w kontrolach, w tym komórkach limfocytów T migdałków, całkowitych limfocytach B obwodowych, naiwnych obwodowych limfocytach B i limfocytach B obwodowej pamięci (Figura 4A). W odróżnieniu od normalnych limfocytów B, kinaza tyrozynowa była konstytutywnie aktywna w komórkach białkowych izolowanych z pacjentów z CLL, co wykazała znakomita aktywność kinazy prezentowana in vitro przez immunokompleks anty-Lyn (Figura 4A). Odkrycia te nie korelowały z ekspresją ZAP-70 ani z obecnością lub brakiem mutacji somatycznych. Stwierdzenie, że aktywność kinazy tyrozynowej była niewykrywalna w immunoprecypitatach otrzymanych w równoległych eksperymentach z przeciwciałami anty-Src, anty-Fyn, anty-c-Fgr i anty-Lck (dane nie przedstawione) potwierdza hipotezę, że Lyn jest kinazą Src odpowiedzialną za anomalna fosforylacja komórkowa tyrozyny B-CLL. Figura 4 Aktywność kinazy Lyn w prawidłowych i limfocytach B CLL przed i po ligacji IgM. (A) Analiza aktywności Lyn w niestymulowanych komórkach B. Normalne komórki odnoszą się do migdałków (T), całkowitych limfocytów B krwi obwodowej (PT), naiwnych limfocytów B krwi obwodowej (PN) i limfocytów B krwi obwodowej pamięci (PM). Normalne i białaczkowe limfocyty B od pacjentów z CLL poddano lizie i Lyn poddano immunoprecypitacji. Immunokompleksy następnie analizowano pod kątem badanej aktywności kinazy in vitro w kierunku substratu peptydowego swoistego wobec Src cdc2 (6. 20) i immunobarwienia anty-Lyn. Dane są reprezentatywne dla eksperymentów przeprowadzonych z 3 różnymi migdałkami, 5 próbkami krwi obwodowej i 40 próbkami B-CLL. (B) Analiza aktywności Lyn w limfocytach B po ligacji IgM. Limfocyty B wyizolowano od zdrowego dawcy i 2 pacjentów z CLL, (CLL nr 29) wyrażających wysokie poziomy i (CLL nr 18) wyrażających niskie poziomy IgM, jak wskazano w analizie metodą cytometrii przepływowej (górne panele). Komórki B inkubowano z anty-ludzką IgM (20 .g / ml) w 37 ° C przez wskazane czasy i aktywność kinazy immunoprecypitatów anty-Lyn wykryto jak opisano w A (dolne panele)
[hasła pokrewne: balsam szostakowskiego zastosowanie, samotne dziewczyny szukajace chłopaków, przychodnia władysławowo ]
[patrz też: balsam szostakowskiego zastosowanie, coleus forskohlii opinie, chirurgia plastyczna szczecin ]