Przewlekłe limfocyty białaczkowe limfocyty B zawierają anormalną kinazę tyrozynową Lyn, przypuszczalnie przyczyniającą się do wadliwej apoptozy czesc 4

Dane reprezentują 3 oddzielne eksperymenty. Aby potwierdzić obecność aktywowanej konformacji Lyn w świeżo przygotowanych komórkach BLL CLL, przeanalizowaliśmy reakcję enzymu na zaangażowanie BCR po ligacji IgM u 15 pacjentów. Figura 4B pokazuje aktywność Lyn wykrytą po ligacji BCR limfocytów B uzyskanych od normalnego osobnika i 2 pacjentów z CLL, typowego pacjenta (CLL nr 18) wyrażającego niskie poziomy IgM i nietypowego przypadku (CLL nr 29) wyrażającego wysokie IgM poziomy. Podczas gdy ligacja IgM wyzwoliła, zgodnie z oczekiwaniami, znaczną aktywację Lyn (9,2-krotnie) w prawidłowych komórkach B, zaobserwowano słaby wzrost aktywności kinazy tyrozynowej w komórkach białaczkowych od obu pacjentów w odniesieniu do wartości wyjściowej. Ponieważ IgM było silnie eksprymowane w normalnych limfocytach B, jak również w komórkach białaczkowych od pacjenta CLL nr. 29, niska reakcja aktywności Lyn na ligację IgM potwierdza pogląd, że większość Lyn jest konstytutywnie aktywna w spoczynkowych komórkach białaczkowych i jest słabo zależna od zaangażowania BCR. Anomalna subkomórkowa lokalizacja Lyn w komórkach B CLL. Ponieważ białko Lyn było wysoce nadeksprymowane w komórkach BLL CLL, analizowaliśmy subkomórkową lokalizację kinazy tyrozynowej w prawidłowych i białaczkowych limfocytach B za pomocą różnicowego ultrawirowania. W tym celu komórki sonikowano w buforze izotonicznym, a cytosol i mikrosomy (cząstki II) oddzielono od innych frakcji subkomórkowych (I w postaci cząstek). Lyn, który jest zakotwiczony w błonach, był jedynie drobnoziarnisty i najczęściej wykryty w mikrosomalnej frakcji normalnych komórek B, ale znaczną podwielokrotność obu izoform enzymów (około 30% całkowitego białka) stwierdzono również w cytozolu wszystkich 14 zbadanych próbek białaczki (Figura 5A, górne panele). Ponadto, podczas gdy enzym był obniżony w prawidłowych komórkach, zarówno mikrosomalne jak i cytozolowe Lyn wyizolowane ze świeżo przygotowanych komórek BLL były konstytutywnie aktywne (Figura 5A, dolne panele). Figura 5 Pozakomórkowa lokalizacja Lyn w komórkach B normalnych i CLL. (A) Analiza metodą ultrawirowania różnicowego. Komórki B sonikowano w buforze izotonicznym i cytosolu, a mikrosomy (II frakcja cząstek, II-P) oddzielano od szczątków komórek i innych cząstek komórkowych (frakcja cząstek stałych, IP) przez ultrawirowanie. Porównywalne porcje różnych frakcji naniesiono na SDS / PAGE i oddzielone białka wybarwiono immunologicznie przeciwciałem anty-Lyn lub przeciwciałami swoistymi dla wskazanych kontrolnych markerów kontrolnych: kompleks II (cząstki I, mitochondria), SERCA2 (cząstki II, endoplazmatycznie retikulum) i CD79b (cząstki II, błona plazmatyczna). Inne próbki poddano immunoprecypitacji za pomocą przeciwciała anty-Lyn, a aktywność kinazy immunokompleksów wykryto in vitro. Dane są reprezentatywne dla eksperymentów przeprowadzonych z 3 różnymi normalnymi i 14 B-CLL próbkami. (B) Mikroskopowa analiza konfokalna gangliozydu GM1 znakowanego podjednostką B toksyny cholery (Texas Red) i Lyn (FITC) w prawidłowych i białaczkowych limfocytach B. Dane są reprezentatywne dla eksperymentów przeprowadzonych z 5 normalnymi i 10 różnymi białaczkowymi próbkami. Oryginalne powiększenie, × 60. Ponieważ Lyn koncentruje się na subdomenach błony zwanych lipidowymi tratwami w spoczynkowych limfocytach B (32, 33), zbadaliśmy mikroskopijny rozkład Lyn na błonie komórkowej złośliwych komórek. Figura 5B pokazuje, że większość Lyn była rzeczywiście rezydentem w tratwach lipidowych w prawidłowych komórkach B, jak oceniono na podstawie kolokalizacji gangliozydem GM1. W przeciwieństwie do tego, Lyn był równomiernie rozmieszczony na całej powierzchni komórki w limfocytach białaczkowych. Aby ocenić, czy mutacja (mutacje) białka Lyn może być odpowiedzialna za anomalne właściwości kinazy tyrozynowej w komórkach B CLL, zsekwencjonowaliśmy cDNA Lyn czterech pacjentów z CLL. Żadna mutacja w sekwencji Lyn nie została zaobserwowana w komórkach białaczkowych w porównaniu z normalną sekwencją cDNA (dane nie pokazane). Lyn bierze udział w wadliwej apoptozie komórek białaczkowych. Następnie zajęliśmy się kwestią, czy zwiększenie ekspresji Lyn i jej aktywności odgrywa rolę w wadliwej apoptozie komórek białaczkowych. W tym celu badaliśmy zależność między Lyn a przeżywalnością komórek złośliwych limfocytów w różnych warunkach eksperymentalnych. Przeanalizowaliśmy komórki białaczkowe hodowane albo za pomocą deksametazonu (Dex) i cyklosporyny A (CsA), o których wiadomo, że indukują apoptozę ludzkich limfocytów (34, 35) lub z PP2 i SU6656, które są selektywnymi inhibitorami Lyn (21). We wstępnych doświadczeniach analizowano odpowiedź na dawkę hodowli komórkowych B-CLL na różne związki i określono stężenie wymagane do indukowania śmierci w 50% komórek białaczkowych (IC50).
[patrz też: odkwaszanie organizmu cytryna, problemy z tarczycą objawy, hydrominum skutki uboczne ]
[więcej w: zaburzenia psychiczne u dzieci, kawa rozpuszczalna skład, ciekawe aplikacje na telefon ]