System FGF odgrywa kluczową rolę w regulowaniu integralności naczyń ad 10

Myszy następnie uśmiercono, krew odsączono przez perfuzję solą fizjologiczną, a mięśnie brzuchatego łydki, płuca i serce wycięto i wysuszono w 55 ° C. Niebieski barwnik Evansa w tkankach ekstrahowano formamidem przez 24 godziny w temperaturze 55 ° C, a jego fluorescencję przy 607 nm mierzono za pomocą czytnika fluorescencyjnego (BioTek). Doświadczenia Transwell-tracera z fluorescencyjnym dekstranem przeprowadzono stosując 24-dołkowy system Transwell HTS Fluoroblok (1,0. M porów, BD). BAEC (2 x 104) wysiano na błonę wkładki Transwell powleczoną 10 .g / ml fibronektyny. Monowarstwę dojrzewało aż do pełnego zlania się i transdukowane adenowirusami. Następnie dodano 2 MDa-dekstran FITC w górnej komorze i mierzono fluorescencję dolnej komory w ustalonych punktach czasowych. Przepuklina elektryczna międzykomórkowa, wskaźnik funkcji bariery komórek śródbłonka, mierzono w czasie rzeczywistym z zastosowaniem elektrycznego systemu wykrywania impulsu komórkowego (ECIS) (Applied BioPhysics) (53). BAEC (5 x 104 na studzienkę) umieszczano na sterylnych 8-komorowych matrycach elektrodach pozłacanych (8W10E) wstępnie powleczonych fibronektyną (10 ug / ml) i hodowano do pełnego zlepienia. Natychmiast po transdukcji adenowirusowej układy elektrod zamontowano w systemie ECIS w inkubatorze (37 ° C, 5% CO2) i podłączono do urządzenia rejestrującego. Odporność na monowarstwę rejestrowano przez 50 godzin w 5-minutowych odstępach. Po 6-godzinnej ekspozycji na adenowirus, pożywkę zawierającą wirus zastąpiono normalną pożywką wzrostową (EGM-2 MV). Transdukcja adenowirusowa i encefalopatyczne oznaczanie VE-kadheryny. Adenowirus (109 PFU) zmieszany z 10. M peptydem antennapedia (52) został poddany transdukcji w tętnicy udowej szczura, jak opisano wcześniej (54). Tętnicę wycięto i przecięto podłużnie, aby odsłonić śródbłonek. Segment tętnicy został umieszczony stroną śródbłonkową do góry i zamocowany kołkami wolframowymi (Fine Science Tools). Po utrwaleniu 2% paraformaldehydem w PBS, standardowe barwienie immunologiczne przeprowadzono przy użyciu przeciwciało anty-VE-kadheryna (Santa Cruz Biotechnology Inc.) i skoniugowane przeciwciało anty-kozie przeciwciało Alexa Fluor 568 (Invitrogen). Przy użyciu mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 510, 20. 30 przekrojów optycznych Z-Stack 1-. M uzyskano i rzutowano na pojedynczą płaszczyznę obrazu. Aby zbadać działanie sFGFR, myszy typu dzikiego zostały zainfekowane (5 x 1010 cząstek wirusowych z 10. M antennapedia), a tętnica szyjna i żyła szyjna zostały zabarwione na kadherynę VE i wizualizowane, jak opisano powyżej. Badanie naczyń mysich tchawicy. Miejsca przecieku w mysich tchawiczych naczyniach krwionośnych wizualizowano za pomocą wyekstrahowanych 100 nm mikrosfer z zielonego fluorescencyjnego polimeru (Duke Scientific Corp.), jak opisano poprzednio (55). W skrócie, 10 dni po wstrzyknięciu kontroli lub adenowirusowi sFGFR1IIIc, znieczulone myszy otrzymały 20 .l (4 x 1011 cząstek) dożylnego wstrzyknięcia fluorescencyjnych mikrokulek. Dwie minuty później mikrosfery wewnątrznaczyniowe usunięto z krwiobiegu przez perfuzję 1% paraformaldehydu w PBS przez 2 minuty pod ciśnieniem 120 mmHg. Tchawice usunięto z myszy i zanurzono w nich na czas dodatkowych 2 godzin, a następnie układ naczyniowy inkubowano z przeciwciałem anty-CD31 (Chemicon), a następnie ze skoniugowanym z Cy3 kozim przeciwciałem przeciw chomiczym IgG (Jackson ImmunoResearch). Całość tchawicy badano przy użyciu mikroskopu konfokalnego Zeiss LSM 510. Mikroskopia elektronowa: komórki. BAEC hodowano do konfluencji na szklanych szkiełkach nakrywkowych 12 mm powlekanych fibronektyną, w którym to momencie były one transdukowane Ad-GFP lub Ad-FGFR1DN-GFP, jak opisano. Po 24 godzinach komórki utrwalono (30 minut, temperatura pokojowa [RT]) w 2% aldehydem glutarowym w 0,1 M roztworze kakodylanu sodu, przepłukano (2 x 10 minut, RT) w 0,1 M roztworze kakodylanu sodu i ponownie utrwalono (1 godzina, RT w ciemności) w 1% OsO4 w 0,1 M kakodylanie sodu. Komórki odwadniano w stopniowanych etanolach, suszono punkt krytyczny przy użyciu krytycznej suszarki punktowej Samdri-795 (Tousimis), powleczonej 3-nanometrową amorficzną warstwą osmu w OPC-60 Osmium Plasma Coater (Filgen), zamontowano na stubach i badano przy wysokim napięciu w mikroskopie XLEM-30 ESEM-FEG (FEI Co.) przy użyciu detekcji elektronów wtórnych. Mikroskopia elektronowa: próbki tętnic. Prawą tętnicę udową samców szczurów zastosowano do ekspresji epigenetycznej przez miejscowe dostarczanie adenowirusowe, jak opisano powyżej
[więcej w: hydrominum skutki uboczne, samotne dziewczyny szukajace chłopaków, przychodnia władysławowo ]
[podobne: rovamycyna, ultramedica kraków, pokrzywka icd 10 ]