System FGF odgrywa kluczową rolę w regulowaniu integralności naczyń ad 5

W niektórych systemach komórkowych blokowanie połączeń adherenowych hamuje prawidłową organizację ciasnych węzłów. Złącza adherenowe odgrywają kluczową rolę nie tylko w regulacji przepuszczalności naczyń, ale również w utrzymaniu stabilności naczyń (24). Ponieważ VE-kadheryna jest głównym białkiem regulującym tworzenie połączeń adherenowych w komórkach śródbłonka, oceniliśmy jego ekspresję w transdukowanych komórkach śródbłonka Ad-FGFR1DN . in vitro. Monowarstwy BAEC były transdukowane, gdy były w pełni konfluentne przy MOI zapewniającym około 30% . 50% transdukcji w celu uniknięcia możliwych toksycznych efektów adenowirusowych. W komórkach eksprymujących dominujący negatywny konstrukt, regularne barwienie VE-kadheryną przy zwojach adheren na obwodzie komórki wykazywało przerwy, które korelowały z przerwami w monowarstwowej zależności fazowej lub różnicowym kontrastem interferencji. Nie zaobserwowano takich zmian w transdukowanych komórkach Ad-GFPa (Figura 6A). Ekspozycja na pułapkę kodowaną przez Ad-FGFR1IIIc-Fc. Doprowadziła do podobnej utraty połączeniowej ekspresji kadheryny VE (Figura 6B). Figura 6 Białka łączące są nieobecne w kontaktach komórka-komórka w komórkach bez sygnalizacji FGF. (A) Immunobarwienie niespokojnej i w pełni konfluentnej monowarstwy śródbłonka. BAEC stransdukowano Ad-GFP lub Ad-FGFR1DN-GFP stosując niskie MOI (odpowiednio 10 i 25) w celu ograniczenia liczby transdukowanych komórek i zminimalizowania toksyczności za pośrednictwem wirusów. Komórki zabarwiono na VE-kadherynę (czerwony) i (3-keteninę (zieleń) 24 godziny później. Wektor Ad-FGFR1DN-GFP ma dwukierunkowy promotor kodujący zarówno GFP jak i FGFR1DN, w ten sposób znakując transdukowane komórki GFP (pokazane na biało). Należy zwrócić uwagę na utratę barwnika VE-kadheryny i .-kateniny w kontaktach komórki-komórka transdukowanych komórek FGFR1DN-GFPa. Strzałka wskazuje na przerwę pomiędzy sąsiednimi komórkami transfekowanymi FGFR1DN-GFPa. Pręty skali: 20 m. (B) Immunobarwienie niespokojnej pojedynczej warstwy śródbłonka (BAEC) transdukowanej Ad-Null lub Ad-sFGFR1IIIc. Komórki wybarwiono na obecność VE-kadheryny (czerwony), p120-kateniny (zielony) i DAPI (niebieski). sFGFR wydzielany był w pożywce; efekt nie jest ograniczony do transdukowanych komórek. Strzałki wskazują przerwy między komórkami śródbłonka. Pręty skali: 20 m. Te same komórki wykazały również utratę ścisłych połączeń, co wykazano przez barwienie zonula occludens-1 (ZO-1) (Figura 7A). Wpływ supresji sygnalizacji FGF na ekspresję VE-kadherynowej błony komórkowej nie był ograniczony do śródbłonka tętniczego, ponieważ transdukcja komórek śródbłonka żyły odpiszczelowej (HSVEC) z Ad-FGFR1DN wykazała podobną utratę kadheryny VE z połączeń komórka-komórka. (Figura 7B). Ponadto analiza ilościowa transdukowanych komórek FGFR1DN potwierdziła obserwacje wzrokowe. Liczba komórek z przerwanym łączącym wybarwianiem VE-kadheryną zwiększała się, gdy wirusowa dawka Ad-FGFR1DN, ale nie Ad-GFP, wzrastała, podczas gdy całkowita gęstość komórek pozostawała niezmieniona, co sugeruje, że efekt zakłócenia sygnalizacji FGF na ekspresję kadheryny VE nie jest spowodowany. do utraty komórek (dodatkowa postać 1, A i B, materiał uzupełniający dostępny online w tym artykule; doi: 10.1172 / JCI35298DS1). Ponadto, metoda Western blot nie wykazała wzrostu rozszczepienia kaspazy 3 w komórkach śródbłonka wyrażających FGFR1DN w porównaniu z kontrolnymi (dodatkowa Figura 1D). Ryc. 7 Podobnie silne hamowanie sygnałowe FGF ma podobny wpływ na skrzyżowanie osiowe i komórki żylne. (A) Immunobarwienie niespokojnej pojedynczej warstwy śródbłonka (BAEC) transdukowanej Ad-GFP lub Ad-FGFR1DN-GFP. Komórki zabarwiono na VE-kadherynę (czerwony) i ZO-1 (zielony). Wektor Ad-FGFR1DN-GFP ma dwukierunkowy promotor kodujący zarówno GFP jak i FGFR1DN, jak opisano powyżej (sygnał GFP jest pokazany na biało). Strzałki wskazują na zmniejszone wybarwianie VE-kadheryny i ZO-1 oraz przerwy między komórkami śródbłonka. Pręty skali: 20 m. (B) Immunobarwienie niespokojnej monowarstwy śródbłonka żylnego. HSVEC stransdukowano Ad-GFP lub Ad-FGFR1DN-GFP i barwiono na VE-kadherynę (czerwony) i p120-kateninę (zielony) 24 godziny później. Należy zanotować utratę wybarwienia VE-kadheryny i p120-kateniny w kontaktach komórka-komórka i tworzenie międzykomórkowych szczelin komórek transdukowanych FGFR1DN-GFPa (białe strzałki). Pręty skali: 20 m. W celu dokładniejszego zbadania tych komórek użyliśmy SEM do zbadania Ad-GFP. i Ad-FGFR1DN. transdukowane monowarstwy śródbłonka in vitro. Monowarstwę eksprymującą ad-GFPa wydawała się ciągła z rzadkimi przerwami, które normalnie występują w hodowlach komórek śródbłonka (Suplemental Fig. 1C). Odwrotnie, monowarstwy eksprymujące Ad-FGFR1DNa wykazały gwałtowny wzrost liczby i wielkości przerw w pojedynczej warstwie (Suplementowa Figura 1C) już po 24 godzinach po transdukcji, po której następował progresywny demontaż monowarstwy.
[przypisy: choroba refluksowa dieta, balsam szostakowskiego zastosowanie, problemy z tarczycą objawy ]
[podobne: medispirant opinie, receptory adrenergiczne, lendacin ]