System FGF odgrywa kluczową rolę w regulowaniu integralności naczyń ad 6

Ponieważ dane przedstawione powyżej sugerują, że FGF służą do ochrony integralności naczyń, mierzono przepuszczalność pojedynczej warstwy komórek śródbłonka in vitro po ekspozycji na FGF i VEGF. Zgodnie z wcześniejszymi wynikami (25) ekspozycja na VEGF-A znacznie zmniejszyła impedancję monowarstwy. Przeciwnie, ekspozycja na FGF1 nieznacznie, ale znacznie zwiększoną impedancję (a zatem zmniejszoną przepuszczalność) (kontrola, 1652.68. 58.3 omów, FGF1: 1776.08. 48.62 omów przy 8 godzinach, P <0,05). Ponadto, wstępne traktowanie przy niskim stężeniu FGF zapobiegało wywołanemu przez VEGF wzrostowi przepuszczalności jednowarstwowej (Figura 8A). Ponadto, podczas gdy w warunkach, w których jednolita warstwa śródbłonka była utrzymywana bez suplementacji surowicy, VEGF-A szybko rozłożył połączenia adherenowe, co wykazano przez ruch kadheryny VE ze styku komórka-komórka do cytozolu (Figura 8B). Jednakże takiego efektu nie zaobserwowano w przypadku leczenia FGF1 (Figura 8B). Tak więc, te eksperymenty pokazują, że sygnalizacja FGF reguluje przepuszczalność śródbłonka i integralność naczyń in vitro i in vivo. Figura 8 Leczenie FGF utrzymuje połączenia EC i zmniejsza przepuszczalność śródbłonka in vitro. (A) Próba przepuszczalności ECIS z użyciem konfluentnej monowarstwa. BAEC dojrzewają do pełnej konfluencji, a pożywkę zastępuje się 1% BSA w EBM-2 (Cambrex). FGF1 (1 ng / ml) lub 1% BSA / EBM-2 dodano we wskazanym punkcie czasowym (strzałka). Sześć godzin później dodano VEGF-A (25 ng / ml) lub 1% BSA / EBM2 we wskazanym punkcie czasowym (strzałka). Po 6 godzinach leczenie FGF znacznie zwiększyło impedancję monowarstwową w porównaniu z leczeniem kontrolnym. (B) Leczenie FGF nie indukuje zakłócenia połączenia na monowarstwach komórek śródbłonka. BAEC dojrzewają do pełnej konfluencji, głodzone 1% BSA w EBM-2 przez 48 godzin i traktowane FGF1 (50 ng / ml) lub VEGF (80 ng / ml) przez 30 minut Uwaga z tym warunkiem, VEGF gwałtownie zakłóca połączenia komórek śródbłonka (białe strzałki), podczas gdy leczenie FGF utrzymuje połączenia podobne do tych w kontrolnej monowarstwie. Pręty skali: 20 m. Hamowanie FGF zaburza kompleks łączący oparty na VE-kadherynie. W celu dalszej analizy ekspresji kadheryny VE, obecność błony komórkowej i kadheryny VE całkowitej komórki oceniano metodą Western blotting Ad-FGFR1DN. i Ad-GFP . transdukowane BAEC po biotynylacji powierzchni komórki. BAEC z Ad-FGFR1DN wykazywały znaczącą utratę VE-kadheryny w osoczu krwi (Figura 9A), pomimo całkowitej ekspresji komórek VE-kadheryny lub innych adherenowych białek łączących, takich jak a-katenina i p120-katenina, jak również białka o wąskim złączu ZO-1. pozostały niezmienione (rysunek 9B). Zwiększono cytoplazmatyczne wybarwianie VE-kadheryną w komórkach Ad-FGFR1DN, co sugeruje redystrybucję VE-kadheryny do cytosolu (Suplementowa Figura 1B). Zależność 9FGF od interakcji VE-kadheryna / p120-katenina i retencji błony komórkowej VE-kadheryny. (A) Zmniejszona VE-kadheryna w transdukowanych BAEC Ad-FGFR1DN .. Spoczynkowe BAEC transdukowano Ad-GFP lub Ad-FGFR1DN, a pojedynczą warstwę traktowano biotyną w celu znakowania białek powierzchniowych komórek. Biotynylowane białka poddano analizie Western blot i sondowano pod kątem kadheryny VE lub N-kadheryny. Całkowite lizaty komórkowe z tych samych próbek analizowano również metodą Western blotting w celu oceny całkowitej ekspresji białka. (B) Analiza Western blot ekspresji białek łączących. Transdukowane BAEC zebrano we wskazanych punktach czasowych, a całkowite lizaty komórkowe analizowano metodą Western blotting. (C) Wpływ traktowania FGF na oddziaływanie VE-kadheryny z kateninami. Monowarstwy BAEC utrzymywano w podłożu podstawowym 0,5% FBS przez 24 godziny, a następnie stymulowano FGF1 (50 ng / ml) we wskazanych czasach. Całkowite lizaty komórkowe poddano immunoprecypitacji przeciwciałem przeciw A. Kadherynie i poddano blottingowi z p120-kateniną, k-keneniną lub przeciwciałem kadheryny VE. (D) Wymaganie sygnalizacji FGFR dla oddziaływania VE-kadheryny z kateninami. Subkonfluentną monowarstwę BAEC (konfluencja ~ 70%) stransdukowano Ad-GFP lub Ad-FGFR1DN i komórki hodowano do dojrzałych połączeń. We wskazanych punktach czasowych przygotowano całkowite lizaty komórkowe i przeprowadzono immunoprecypitację z przeciwciałem przeciwko kadherynie VE, po czym przeprowadzono immunoblotting z użyciem p120-kateniny, a-kateniny lub przeciwciała przeciwko kadherynie VE. Gdy monowarstwy tworzą dojrzałe połączenia, wzrasta oddziaływanie VE-kadheryna / p120-katenina (Ad-GFP), podczas gdy interakcja ta była zmniejszona w komórkach traktowanych Ad-FGFR1DNp. Komórki nietransdukowane traktowano 100 .M PV przez 10 minut przed lizą komórek, wykazując zakłócone oddziaływanie VE-kadheryna / p120. Ekspresja N-kadheryny, o której wiadomo, że kontroluje poziomy VE-kadheryny w komórkach śródbłonka, nie uległa zmianie na biotynylowanej (powierzchni komórkowej) lub całkowitej frakcji białkowej w komórkach FGFR1DN (Figura 9A) (26)
[hasła pokrewne: sennik karmienie piersią, przychodnia władysławowo, piramida żywieniowa dla dzieci ]
[patrz też: medispirant żel pod prysznic opinie, femoston mini, kamila biedrzycka osica wikipedia ]