System FGF odgrywa kluczową rolę w regulowaniu integralności naczyń ad 9

W przypadku braku sygnalizacji FGF, kadheryna VE podlega odsprzęganiu p120-kateniny prowadząc do utraty adherenów i ciasnych połączeń, zwiększonej nieszczelności naczyniowej i demontażu istniejącego układu naczyniowego. Wyniki te pokazują istotną rolę sygnalizacji FGF w utrzymaniu integralności naczyń. Metody Budowa genów. Mysi klon cDNA FGFR1 (flg) a 341-733 był prezentem A. Mansukhani (New York University, New York, New York, USA). Skrócona forma FGFR1 pozbawiona części cytoplazmatycznej receptora (FGFR1DN) koduje całe zewnątrzkomórkowe domeny 2 Ig z 32 aminokwasami regionu wewnątrzkomórkowego (50). Aby zaprojektować konstrukty sFGFR, amplifikowano zewnątrzkomórkowe części mysiego cDNA FGFR1DN (izoforma FGFR1IIIc), mysie FGFR3IIIb i mysie cDNA FGFR3IIIc (dar D. Ornitza, Washington University w St. Louis School of Medicine, St Louis, Missouri, USA) przez PCR z 5. HindIII i 3. Witryny BamHI, odpowiednio. Po trawieniu enzymem restrykcyjnym produkty PCR połączono w ramce z regionem zawiasowym-CH2-CH3 ludzkiej IgG1 (wektor ekspresyjny CDM7Ba / CD5-Ig) (20). CDNA FGFR1DN i sFGFR subklonowano do wektora wahadłowego adenowirusa i generowano niezrekombinowane, rekombinowane wektory adenowirusowe i propagowano do wysokiego miana. Przeciwciała. Przeciwciała stosowane do immunoprecypitacji, Western blotting i immunofluorescencji obejmują antyfosfo- i całkowitą Erk1 / 2, anty-kateninę i anty-kaspazę-3 (Cell Signaling Technology), anty-VE-kadherynę (Santa Cruz Biotechnology Inc. i Research Diagnostics Inc.), anty-p120-katenina (BD Transdction Laboratories firmy BD Biosciences.), anty-ZO-1 (Invitrogen), N-kadheryna (Zymed Laboratories Inc.) i anty-tubulina (Sigma-Aldrich). ). Hodowla komórkowa i transdukcja adenowirusowa. BAEC i HSVEC hodowano w temperaturze 37 ° C w 5% CO2 w pożywce EGM-2 MV (Cambrex) lub pełnej pożywce MCDB-131 (VEC Technologies Inc.) i wstępnie powleczono fibronektyną (10 ug / ml), o ile nie podano inaczej. określony. Wektory adenowirusowe transdukowano przy MOI 10. 100 PFU / komórkę dla Ad-FGFR1DN lub 50. 200 wirusowych cząstek / komórkę dla Ad-sFGFR. Pożywkę do infekcji zastępowano 4. 6 godzin później normalnym podłożem wzrostowym. Western blotting i immunoprecypitacja. Opisaną wcześniej procedurę zastosowano z niewielkimi modyfikacjami (51). W skrócie, komórki przemyto dwukrotnie lodowato zimnym Ca2 + i Mg2 + PBS i poddano lizie w buforze RIPA: 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1% NP40, 0,5% dezoksycholanie sodu, 0,1% SDS, 2 mM CaCl2 , x kompletną mieszaninę inhibitorów proteazy (Roche) i mM ortowanadanu sodu. W przypadku badań fosforylacji Erk1 / 2, w celu wyeliminowania możliwego hartowania sygnału, który występuje podczas sondowania tego samego białka przy użyciu różnych przeciwciał na tej samej membranie, identyczne próbki przeprowadzono w dwóch powtórzeniach, a membrany zostały wymieszane z fosfo-Erk1 / 2 lub totalnie Erk przeciwciało. W celu immunoprecypitacji próbki oczyszczono na kulkach białka A / G (Calbiochem) przez godzinę w temperaturze 4 ° C. VE-kadherynę poddano immunoprecypitacji z 500 .g ekstraktu, stosując 2 .g przeciwciała przeciwko .-kadherynie, a następnie 20 .l kulek białka A / G. Kulki przemyto 5 razy zimnym PBS, gotowano w buforze do ładowania SDS-PAGE i rozdzielono metodą SDS-PAGE. Tam, gdzie to wskazano, komórki traktowano przed lizą 100 .M PV przez 5 minut w 37 ° C w celu zahamowania fosfataz tyrozynowych. Immunofluorescencja. Immunocytochemię przeprowadzono standardową procedurą wykorzystującą przeciwciała opisane powyżej. W skrócie, komórki utrwalono 2% paraformaldehydem i permeabilizowano 0,1% Triton X-100. Inkubację z pierwotnym przeciwciałem śledzono przez inkubację ze skoniugowanymi z drugorzędowymi przeciwciałami Alexa Fluor (Invitrogen). Próbki badano pod mikroskopem konfokalnym Zeiss LSM 510. Biotynylacja białka powierzchni komórki. Dwadzieścia cztery godziny po transdukcji adenowirusa komórki przemyto dwukrotnie lodowato zimnym PBS i inkubowano z długołańcuchową biotyną o długości 0,5 mg / ml, długołańcuchową biotyną sulfo-N-hydroksysukcynimidu (Pierce Biotechnology) w PBS, pH 7,4, przez 15 minut w 4 ° C. DO. Reakcję biotynylowania zgaszono lodowatym 1% BSA-PBS. Lizat komórkowy inkubowano z unieruchomioną NeutrAvidin (Pierce Biotechnology) w 4 ° C w celu oddzielenia biotynylowanych białek. Zakażenie Ad-sFGFR i pomiar sFGFR w krwi myszy i tkankach. Wszystkie doświadczenia na zwierzętach przeprowadzono zgodnie z protokołem zatwierdzonym przez Institutional Animal Care and Use Committee w Dartmouth College. Samcom myszy C57BL / 6 typu dzikiego lub samcom myszy NU / NU (laboratoria Charles River) wstrzyknięto 5x 1010 cząsteczek wirusowych z żyły ogonowej w połączeniu z 10. M peptydu antennapedia (52) (prezent od WC
[przypisy: zaburzenia psychiczne u dzieci, piramida żywieniowa dla dzieci, problemy z tarczycą objawy ]
[hasła pokrewne: xarelto apteka internetowa, urofuraginum dla dzieci, zgrubienie w pachwinie ]