System FGF odgrywa kluczową rolę w regulowaniu integralności naczyń ad

Zatem FGF odgrywają główną rolę w utrzymaniu integralności naczyniowej w istniejącym dojrzałym układzie naczyniowym. Wyniki Hamowanie sygnalizacji FGF za pomocą pułapek sFGFR. Aby zahamować sygnalizację FGF w układzie naczyniowym dorosłych myszy, zastosowano systemową ekspresję sFGFR (17), w której pośredniczy adenowirus, podobnie jak wcześniej stosowana strategia anty-VEGF (18). Wybrano trzy izoformy splicingowe FGFR: FGFR1IIIc, FGFR3IIIb i FGFR3IIIc. FGFR1IIIc wiąże FGF1, -2, -4, -5, -6 i -8, podczas gdy FGFR3IIIb wiąże głównie FGF1 i FGF9 z niższym powinowactwem i -20. FGFR3IIIc ma szeroką swoistość wiązania wobec FGF1, -2, -4, -8, -9, -17 i -20 (13). Zdolność tych pułapek FGF do neutralizacji aktywacji FGF badano w komórkach śródbłonka aorty bydlęcej (BAEC) po transdukcji różnymi ilościami adenowirusów kodujących sFGFR. Zależną od dawki supresję fosforylacji Erk1 / 2 indukowanej FGF1 obserwowano w BAEC transdukowanych Ad-sFGFR1IIIc (Figura 1A). Podczas gdy wszystkie sFGFR hamowały fosforylację Erk1 / 2 wywołaną przez FGF1, sFGFR3IIIb, który nie wiąże się z FGF2, nie hamował aktywacji Erk1 / 2 indukowanej przez FGF2 (Figura 1, B i C). Rysunek Weryfikacja systemu sFGFR. (A) sFGFR blokuje fosforylację Erk1 / 2 wywołaną FGF in vitro w sposób zależny od dawki. Ad-GFP i Ad-sFGFR1IIIc transdukowano w BAEC i stymulowano wskazanym stężeniem FGF1 przez 10 minut. Całkowite lizaty komórkowe poddano analizie Western blotting. p-Erkl / 2, fosfo-Erk / 2; t-Erk1 / 2, całkowita Erk1 / 2; VP, cząsteczki wirusowe. (B) sFGFR skutecznie hamują aktywację Erk1 / 2 indukowaną przez FGF1. Ad-Null, Ad-sFGFR1IIIc, Ad-sFGFR3IIIb i Ad-sFGFR3IIIc transdukowano w BAEC i stymulowano FGF1 przez 5 minut. (C) sFGFR3IIIb nie hamuje indukowanej FGF2 aktywacji Erk1 / 2. Ad-Null i Ad-sFGFR transdukowano w BAEC i stymulowano FGF2 przez 5 minut. (D) Poziomy ekspresji sFGFR w osoczu u myszy. Ad-Null (kontrola) lub Ad-sFGFR1IIIc (5 × 1010 cząstek wirusa) wstrzyknięto myszom C57BL / 6, a próbki krwi pobrano we wskazanych punktach czasowych. Poziom sFGFR mierzono za pomocą systemu ELISA wykrywającego ludzką IgG-Fc. Dane są wyświetlane jako średnie. SD, n = 4 w każdej grupie. (E) Rozkład tkankowy sFGFR. Po 10 dniach wstrzyknięcia Ad-Null (kontrola) lub Ad-sFGFR1IIIc (5 x 1010 cząstek wirusowych) pobrano próbki tkanek i ekstrahowano białko całkowite. Następnie przeprowadzono testy ELISA wykrywające ludzką IgG-Fc. Dane są wyświetlane jako średnie. SD, 4 zwierzęta w każdej grupie. (F) Zmiana masy ciała po wstrzyknięciu sFGFR. Dziesięciotygodniowe myszy C57BL / 6 wstrzyknięto adenowirusy (5 × 1010 cząstek wirusowych), a masę ciała mierzono co tydzień. Dane są wyświetlane jako średnie. SD, n = 4 w każdej grupie. * P <0,05, test ucznia. Aby uzyskać ogólnoustrojową ekspresję tych pułapek u myszy, adenowirusy kodujące konstrukty sFGFR1IIIc i sFGFR3IIIb wstrzyknięto dożylnie myszom C57BL / 6, a poziomy w krążeniu określono za pomocą testu ELISA. Wysokie poziomy w osoczu obu konstruktów wykrywano począwszy od 3. 4 dni po wstrzyknięciu i utrzymywano przez około 3 tygodnie (Figura 1D). Po ekspresji pułapki sFGF wykazywały równomierną dystrybucję i wykryto je w podobnych ilościach w różnych tkankach myszy (Figura 1E). Myszy eksponowane na pułapki sFGFR1IIIc-Fc nie przybierały na wadze, podczas gdy pułapki były wyrażane, wznawiając przyrost masy ciała, gdy wyrażenie spadło (Figura 1F). Jest to zgodne ze znaną rolą angiogenezy w tworzeniu i utrzymywaniu tkanki tłuszczowej (19). Aby zminimalizować możliwość, że reakcje zapalne / immunologiczne wywoływane przez adenowirusy mogą zaburzyć wynik, użyliśmy konstruktu Fc z mutacją, która eliminuje wiązanie receptora Fc (20). Ponadto, myszy bez myszy, którym wstrzyknięto adenowirusy zerowe lub sFGFR1IIIc, nie miały zmiany masy ciała (Ad-Null, kontrola, 33,94 . 1,03 g, sFGFR1IIIc, 32,88. 0,48 g w 8 tygodniu) pomimo wysokich poziomów sFGFR1IIIc w osoczu (64,2. 18,3. g / ml w tygodniu 4), który utrzymywał się przez co najmniej 8 tygodni (25,8 a 5,9 .g / ml w tygodniu 8). To zdecydowanie dowodzi, że reakcja zapalna, jeśli w ogóle, nie miała wpływu na wpływ zaobserwowany w przypadku innych pułapek sFGFR. Przerwanie śródbłonkowej sygnalizacji FGF wpływa na integralność i przepuszczalność naczynia. Wiadomo, że układ naczyniowy tchawicy jest zakłócany przez ogólnoustrojową ekspresję krążących pułapek VEGF (1). Po ogólnoustrojowej ekspresji sFGFR1IIIc obserwowano utratę integralności naczyniowej w krążeniu tchawicy, co wykazano przez wynaczynienie 100 nm wstrzykniętych dożylnie cząstek mikrosfer, które nie były obecne u myszy eksponowanych na adenowirus kontrolny (Figura 2A). Aby dodatkowo scharakteryzować tę utratę integralności naczyniowej, oceniano przepuszczalność naczyń u normalnych myszy C57BL / 6 po ogólnoustrojowej ekspresji sFGFR1IIIc, sFGFR3IIIb lub konstruktu kontrolnego. [podobne: transcendencja chomikuj, brzoskwinie wartości odżywcze, kawa rozpuszczalna skład ] [przypisy: transcendencja chomikuj, zgrubienie w pachwinie, rovamycyna ]