Wykorzystanie profilowania transkrypcyjnego do opracowania testu diagnostycznego tolerancji operacyjnej u biorców przeszczepów wątroby ad 5

NK, TCR + i 3TCR + proporcje limfocytów krwi obwodowej korelowały również z ekspresją wielu pojedynczych genów zawartych w zestawie 26-sondy pochodzącym z PAM, chociaż wykazano, że tylko częstotliwość komórek TCR + T była znacząco związane z zestawem 26-sondowym jako całością (P <0,0154). Wyniki tych analiz wskazują, że zarówno komórki T NK, jak i TCR + wpływają na wzorce ekspresji krwi obwodowej związane z tolerancją. Biorąc pod uwagę, że biorcy TOL i nie-TOL różnią się liczbą limfocytów T TCR + krwi obwodowej (11), jasne jest, że zależną od tolerancji ekspresję genów różnicowych można przypisać, przynajmniej w części, zwiększonej liczbie. Komórki TCR + T w biorcach TOL. Jeśli chodzi o komórki NK, które są obecne w podobnej liczbie u biorców TOL i innych niż TOL, postawiliśmy hipotezę, że zaobserwowana istotna korelacja może wynikać ze zmian w ich programie transkrypcji. Aby przetestować tę hipotezę i dalej ocenić udział innych podzbiorów PBMC, przeprowadziliśmy eksperymenty qPCR w celu pomiaru ekspresji 22 najbardziej znaczących genów z Tabeli 3 w podzbiorach komórek posortowanych z wybranej grupy 5 pacjentów z TOL i 5 bez TOL. Zbiór 22 genów był głównie eksprymowany przez komórki jednojądrzaste komórek CD8 +,. TCR + i nie. T (figura 7 i tabela 4). Porównanie próbek TOL i innych niż TOL ujawniło znaczące różnice ekspresji w podgrupach komórek CD4 +, CD8 +,. TCR + i nie. T (Fig. 7 i Tabela 4). Ponadto, poziomy białka IL-2RB, KLRB1, CD244, CD9, KLRF1, CD160 i SLAMF7 oceniano za pomocą cytometrii przepływowej na komórkach CD4 +, CD8 +,. TCR + T, NK, CD19 + i NKT z 6 TOL, 6 non -TOL i 5 zdrowych osób. Białka te były głównie eksprymowane na komórkach T NK, NKT i. TCR +, przy czym zauważono znaczące różnice pomiędzy osobami z TOL, nie-TOL i CONT (Suplementowa Figura 1, A i B, materiał uzupełniający dostępny online z tym artykułem; : 10,1172 / JCI35342DS1). Odkrycia te wskazują, że biorcy TOL i nie-TOL różnią się programem ekspresji kilku podzbiorów PBMC, głównie komórek T V. 1TCR + i komórek NK, i że w wielu przypadkach te zmiany ekspresji są unikalne dla stanu tolerancji. Tak więc wydaje się, że wzorce ekspresji związane z tolerancją kształtowane są zarówno przez różnice w liczbie komórek TCR + T, jak i przez zmiany funkcjonalne w różnych podgrupach PBMC. Figura 7 Jakościowa ekspresja 22 najbardziej pouczających genów ocenianych przez qPCR w posortowanych limfocytach krwi obwodowej. Względna ekspresja 22 genów rozróżniających TOL od próbek innych niż TOL w posortowanych komórkach T CD4 +, CD8 +,. TCR + i komórkach jednojądrzastych non. T otrzymanych od 5 TOL i 5 osób biorących udział w TOL. Dane wyrażono jako średnią znormalizowaną. Ct. SD. Pokazano tu tylko geny, w których zaobserwowano różnice statystyczne. * P <0,05 (test t) między TOL i non-TOL Tabela 4 Istotność statystyczna różnic w ekspresji genów między osobami biorącymi udział w TOL i nie-TOL w posortowanym podzbiorze limfocytów. Omówienie Wcześniej donoszono, że profilowanie ekspresji genów za pomocą próbek krwi obwodowej i mikromacierzy oligonukleotydowych stanowi wysokoprzepustowe podejście do analizy biologii leżącej u podstaw tolerancji operacyjnej w transplantacji ludzkiej wątroby (11). Obecne badanie zostało zaprojektowane w celu określenia, czy to podejście można zastosować do identyfikacji klasyfikatorów genomów, które (a) zawierają niewielką liczbę genów, (b) zapewniają wysoką dokładność diagnostyczną w identyfikacji tolerancyjnych biorców, oraz (c) dają powtarzalne wyniki w całej populacji. różne platformy transkrypcyjne. Najpierw przeanalizowaliśmy próbki krwi obwodowej uzyskane od operacyjnie tolerancyjnych biorców wątroby i nietolerujących biorców wymagających immunosupresji podtrzymującej z użyciem mikromacierzy Affymetrix. Zdolność diagnostyczną powstałego 26-sondowego klasyfikatora genetycznego testowano na niezależnej kohorcie 19 biorców STA. Pacjenci ci zostali wybrani zgodnie z kryteriami klinicznymi najczęściej stosowanymi przy zapisywaniu pacjentów do prób odsadzenia immunosupresyjnego (1) i dlatego są reprezentatywni dla różnorodności pacjentów, u których zastosowanoby test diagnostyczny oparty na zidentyfikowanym sygnaturze genetycznej, jeśli zostanie on przyjęty w szerokim zakresie klinicznym. posługiwać się. Prognozowanie statusu tolerancji na podstawie zidentyfikowanego podpisu genowego spowodowało identyfikację 4 z 19 potencjalnie tolerancyjnych biorców (26%), co odpowiada częstości występowania tolerancji operacyjnej obserwowanej u pacjentów wybranych zgodnie z powyższymi kryteriami klinicznymi (1, 5, 8) . Najbardziej pouczające geny wybrane w eksperymentach na mikromacierzy zostały następnie zwalidowane na platformie qPCR [więcej w: zaburzenia psychiczne u dzieci, uzależnienie od leków przeciwbólowych, prostowanie keratynowe cennik ] [przypisy: problemy z tarczycą objawy, pęknięcie pierścienia włóknistego, operacja ścięgna achillesa ]