Wykorzystanie profilowania transkrypcyjnego do opracowania testu diagnostycznego tolerancji operacyjnej u biorców przeszczepów wątroby ad 8

Dodatkowo, próbki krwi obwodowej uzyskano również z 16 dopasowanych pod względem wieku zdrowych kontrolnych (CONT) i 19 biorców STA, którzy spełniali wyżej wymienione kryteria kliniczne dla odstawienia leku. U pacjentów spełniających te kryteria częstość występowania tolerancji operacyjnej wynosi od 20% do 30% (5, 8). Charakterystyka kliniczna i demograficzna pacjentów uwzględnionych w badaniu podsumowano w Tabeli 1. Badanie zostało zaakceptowane przez Institutional Review Boards wszystkich uczestniczących instytucji i uzyskano świadomą zgodę od wszystkich pacjentów. Ostatnio opublikowano raport zawierający wyniki badań immunofenotypowania komórek krwi wraz z wstępnymi danymi ekspresji genów mikromacierzy uzyskanymi od podgrupy pacjentów włączonych do niniejszego badania (11). Eksperymenty mikromacierzy. Eksperymenty mikromacierzowe przeprowadzono na PBMC uzyskanych od 21 osób, które nie otrzymały TOL, 17 TOL i 19 STA. PBMC izolowano stosując warstwę Ficoll-Hypaque (Amersham Biosciences), całkowite RNA ekstrahowano odczynnikiem TRIzol (Life Technologies), a uzyskane próbki cRNA hybrydyzowano na macierzach Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 zawierających 54 675 sond dla 47 000 transkryptów (Affymetrix). . Obsługa próbek i ekstrakcja RNA zostały wykonane przez tego samego badacza we wszystkich przypadkach (M. Martínez-Llordella). Normalizacja danych mikromacierzy. Dane mikromacierzy z 57 próbek (21 nie-TOL, 17 TOL i 19 STA) normalizowano stosując algorytm wielowarstwowy z dostosowaną zawartością guanidyna-cytozyna, który oblicza wartości ekspresji z wartości intensywności sond zawierających informacje o sekwencji sond (28). Następnie zastosowano konserwatywny etap filtrowania sondy z wyłączeniem tych sond, które nie osiągnęły wartości ekspresji log2 wynoszącej 5 w co najmniej próbce, co spowodowało wybór łącznie 23 782 sond z pierwotnego zestawu 54,675. W celu wyeliminowania nietypowych wariacji eksperymentalnych lub efektów wsadowych obserwowanych w kolejnych seriach eksperymentów na mikromacierzach, zastosowaliśmy podejście ComBat, które wykorzystuje nieparametryczne empiryczne struktury Bayes do korekty danych (29). Różnicowa ocena i prognozowanie ekspresji. Zarys projektu badania przedstawiono na rysunku 1. Najpierw użyliśmy SAM (30) do identyfikacji genów różnicowo wyrażanych pomiędzy grupami TOL i nie-TOL (odpowiednio 17 i 21 próbek) w przefiltrowanym 23782-zestawie sond. SAM używa zmodyfikowanych statystyk testu t dla każdego genu zestawu danych i czynnika krówki do obliczenia wartości t, kontrolując w ten sposób nierealistycznie niskie odchylenia standardowe dla każdego genu. Co więcej, SAM pozwala kontrolować FDR, wybierając próg dla różnicy między rzeczywistym wynikiem testu a wynikiem uzyskanym z powtarzanych permutacji badanych grup. W obecnym badaniu wykorzystaliśmy selekcję SAM przy użyciu FDR poniżej 5% i 000 permutacji w 3 grupach porównawczych: TOL versus Non-TOL, TOL HCV-positive vs. Non-TOL HCV-positive oraz TOL HCV-negative versus non-TOL TOL HCV-ujemny. Różnicową ekspresję genu badano dalej, stosując najbliższy skurczony klasyfikator centroidu zaimplementowany w pakiecie PAM (31) w celu zidentyfikowania w zestawie 23782-sondy minimalnego zestawu genów zdolnych do przewidywania stanu tolerancji przy ogólnym poziomie błędu wynoszącym mniej niż 5%. . Ta metoda obejmuje wewnętrzny etap weryfikacji krzyżowej podczas wyboru cech, w którym model pasuje do 90% próbek, a następnie przewidywana jest klasa pozostałych 10%. Tę procedurę powtarza się 10 razy, aby obliczyć ogólny błąd (10-krotna walidacja krzyżowa). Klasyfikator PAM został następnie użyty w 38-próbnym zestawie do wykonania wielowymiarowej analizy skalowania na podstawie odległości Euklidesa między próbkami, zaimplementowanej przez funkcję isoMDS w R. Ta metoda jest w stanie wizualizować dane wielowymiarowe (takie jak wielokrotne wyrażenie). pomiary) na wykresie 3D, w którym odległości między próbkami są zachowane w niezmienionej postaci. Ostatecznie klasyfikator PAM zastosowano do przewidywania klasy w zestawie 19 próbek pobranych od pacjentów z STA. Szczegółowe informacje na temat zestawu danych ekspresji mikromacierzy dostępne w Internecie (http://bioinfo.ciberehd.org/asf/). Korelacja danych z mikromacierzy ze zmiennymi klinicznymi i podgrupami PBMC. Zastosowano globalny algorytm (32) z pakietu Bioconductor (http://bioconductor.wustl.edu/BioC2.1/bioc/html/globaltest.html) w celu określenia potencjalnie zakłócających zmiennych klinicznych, takich jak wiek pacjenta, płeć, czas z transplantacji, statusu HCV, terapii immunosupresyjnej (takrolimus, cyklosporyna A lub mykofenolan mophetil) i liczby monocytów krwi obwodowej, limfocytów i neutrofilów mogą wpływać na poziomy ekspresji genów
[patrz też: przychodnia władysławowo, operacja ścięgna achillesa, chirurgia plastyczna szczecin ]
[patrz też: licówki porcelanowe cennik, balsam szostakowskiego zastosowanie, coleus forskohlii opinie ]