Wykorzystanie profilowania transkrypcyjnego do opracowania testu diagnostycznego tolerancji operacyjnej u biorców przeszczepów wątroby ad 9

Ta sama strategia została wykorzystana do oszacowania korelacji między danymi dotyczącymi ekspresji w mikromacierzy a odsetkiem komórek CD4 + CD25 +, CD4 + Foxp3 +, CD4 +, CD8 +, CD19 +, NKT, całkowitego. TCR +, V. 1TCR + i V. 2TCR + we krwi obwodowej . Globaltest to metoda określania, czy wzorzec ekspresji uprzednio określonej grupy genów jest powiązany ze zmienną kliniczną, która może być zmienną dyskretną lub ciągłym. Test ten opiera się na empirycznym bayesowskim uogólnionym modelu liniowym, w którym współczynniki regresji między danymi dotyczącymi ekspresji genów a pomiarami klinicznymi są zmiennymi losowymi. Test dobroci dopasowania jest stosowany na podstawie tego modelu. Metoda globalna oblicza statystyczną wartość Q i P w celu zmierzenia wpływu naszej grupy genów na mierzoną zmienną kliniczną. Dla każdej sondy wpływ (Q) w przewidywaniu mierzonej zmiennej klinicznej jest szacowany na podstawie wartości oczekiwanej i zaliczany do badanych sond. Waga każdej sondy jest również oceniana przez wynik z-z uwzględnieniem standardowego odchylenia każdej sondy we wszystkich próbkach użytych w analizie. Eksperymenty qPCR. Wzór ekspresji grupy 68 docelowych genów i 4 genów uspokajających (18S, GUS, HPRT1 i GAPDH) mierzono za pomocą qPCR z zastosowaniem systemu ABI 7900 Sequence Detection System i mikroprzepływowych kart PCR LDA (PE Applied Biosystems) na pobranych próbkach krwi obwodowej od 15 osób bez TOL, 16 TOL i 16 osób z grupy CONT. Wybrane geny docelowe obejmowały 24 geny zidentyfikowane przez PAM, 44 geny wybrane spośród najbardziej wysoko klasyfikowanych na liście genów pochodzących z SAM i 6 genów (UBD, HLA-DOB, FOXP3, LTBP3, MAN1A1, LGALS3) wybranych na podstawie poprzednie raporty (11, 23, 26, 33, 34). W celu ilościowego oznaczenia poziomów mRNA normalizowaliśmy ekspresję genów docelowych do genu odpowiedzialnego za utrzymanie HCRT1 (który został uznany za najbardziej stabilnie wyrażany gen spośród wybranych 4 genów uspokajających) i przedstawił wyniki jako względną ekspresję między cDNA celu próbki i skalibrowana próbka zgodnie z metodą Ct. Wszystkie eksperymenty qPCR przeprowadzono w dwóch powtórzeniach. Całkowity RNA potraktowano odczynnikiem DNAse (Ambion; Applied Biosystems) i odwrotną transkrypcję przeprowadzono stosując Multiscribed Enzym z odwrotną transkryptazą (PE Applied Biosystems). Wyniki analizowano stosując standardowy niesparowany test t dla dwóch klas. Odtwarzalność pomiarów ekspresji genów oceniano poprzez porównanie zmienności między testami interpatenta i między testami w zestawie eksperymentów qPCR, które obejmowały 22 geny i próbki od 16 biorców. Do tych eksperymentów użyto 2 próbek krwi obwodowej pobranych w 2 oddzielnych punktach czasowych (średnio, 57 dni, zakres, 11. 244 dni). Zmienność między testami została zdefiniowana jako zmienność między seriami PCR przeprowadzonymi przy użyciu 2 różnych próbek krwi obwodowej od tego samego pacjenta. Aby zbudować modele klasyfikacji zawierające minimalny zestaw cech (genów) o najniższym możliwym błędem klasyfikacji zarówno w treningu, jak i niezależnych zestawach testowych, wykorzystaliśmy MiPP (35) na 34 docelowych genach różnicowo wyrażonych między próbami TOL i nie-TOL (test t ; P <0,05). MiPP to niedawno opracowana metoda oceny wydajności modelu predykcji, który oblicza sumę prawdopodobieństw klasyfikacji tylnej, obciążonych liczbą nieprawidłowo sklasyfikowanych próbek. Aplikacja MiPP wykonuje wyczerpujące wyszukiwanie modeli genów poprzez sekwencyjny wybór najbardziej przewidywalnych genów i automatyczne usuwanie wybranych genów w kolejnych seriach. W naszej analizie przeprowadziliśmy 10 kolejnych przebiegów i wykorzystaliśmy wszystkie algorytmy predykcyjne zawarte w aplikacji MiPP (liniowa analiza dyskryminacyjna, kwadratowa analiza dyskryminacyjna, uczenie maszynowe wektora nośnego i regresja logistyczna). Przeprowadzono wewnętrzną walidację obliczeniową, stosując zarówno 10-krotną walidację krzyżową, jak i walidację z podziałem losowym (liczba podziałów = 100). Uzyskane modele kompozytowe zastosowano następnie do przewidywania tolerancji w niezależnym zestawie testowym 11 próbek TOL i 12 próbek innych niż TOL, dla których nie były dostępne dane z mikromacierzy. Wybrano 3 modele o niższym współczynniku błędu klasyfikacji (w zbiorze treningowym i zestawie testowym). Immunofenotypowanie krwi obwodowej. Dane dotyczące immunofenotypowania cytometrii przepływowej z PBMC uzyskanych od 16 osób z TOL i 16 osób, które nie otrzymały TOL, zostały opisane w innym miejscu (11). W obecnym badaniu ocenialiśmy proporcje CD4 + CD25 +, CD4 + Foxp3 +, całkowite rejony TCR +, 1 T TCR +, 2 2 T TCR +, CD19 +, NK i NKT na próbkach krwi obwodowej uzyskanych z 19 Odbiorcy STA oraz od TOL i 5 osób spoza TOL (z których nie były dostępne żadne wcześniejsze dane) [przypisy: kawa rozpuszczalna skład, sennik karmienie piersią, piramida żywieniowa dla dzieci ] [hasła pokrewne: chirurgia plastyczna szczecin, zaburzenia psychiczne u dzieci, kawa rozpuszczalna skład ]